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1、ICS11.220B41DB21#省地方标准DB 21/ #X#大肠杆菌PCR检测方法Method of PCR for the detection of Escherichia coli点击此处添加与国际标准一致性程度的标识#-#-#发布#-#-#实施#省质量技术监督局发布4 / 6前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草.本标准由#省动物疫病预防控制中心提出.本标准由#省畜牧兽医局归口.本标准起草单位：#省动物疫病预防控制中心、#省动物医学研究院.本标准主要起草人：赵凤菊,关淼,关乃鹏,李清竹,陈瑶大肠杆菌PCR检测方法1 范围本标准规定了大肠杆菌PCR检测方法的技术要求.本标
2、准适用于大肠杆菌的诊断、监测与流行病学调查,适用于猪粪便、脏器与纯培养物中大肠杆菌的检测.本标准中的试验操作应在生物安全级BSL-2以上的实验室进行.2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件,其最新版本包括所有的修改单适用于本文件.中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范3 缩略语下列缩略语适用于本标准.E.coli：大肠杆菌Escherichia coliDNA：脱氧核糖核酸Diethylpyrocarbonatebp：碱基对base pairPCR：聚合酶链式反应polyme
3、rase chain reactiondNTP：脱氧核糖核苷三磷酸Deoxy-ribonucleoside triphosphateTaq酶：Ex Taq DNA聚合酶Taq DNA polymeraseTAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液Tris acetate-EDTA buffer4 原理根据E.coli保守基因序列设计一对引物,在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以引物为延伸起点,通过变性、退火和延伸,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA.5 仪器和器材本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻离心机最大离心力12 000g以上、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像
4、系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管和0.2mL离心管、微量移液器和吸头等.6 试剂和材料6.1 DNAzol Reagent：DNA抽提试剂,外观为淡绿色,于48保存.6.2 无水乙醇：-20预冷.6.3 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制,-20预冷.6.4 DNA聚合酶：Ex Taq DNA聚合酶5 U/L.6.5 dNTP.6.6 引物：引物浓度为20mol/L；上游引物序列为5- GCCTCGCCTGGAGAATGA-3,下游引物序列为5-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3.6.7 阴性对照：灭菌双蒸水6.8 阳性对照：E.coli ATCC25922.6.9 无菌生理
5、盐水.6.10 TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液,6.11 溴化乙锭.6.12 DL2000 DNA Marker.注：本技术规范中使用的试剂,除另有说明外,所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无菌的容器分装.7 操作步骤7.1 样品的采集、前处理、存放与运输7.1.1 采样注意事项采样与样品前处理过程中应戴一次性手套,样本间不得交叉污染.7.1.2 采样工具药匙、15 mL离心管和1.5 mL离心管经121士2均高压灭菌20 min；剪刀、镊子经160干热灭菌2h.7.1.3 内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器肝脏、脾脏、肺脏装入灭菌15mL离心管中,编号,送实验室.称取1 g 病料
6、进行研磨,然后加入1mL无菌生理盐水,混匀,3000 rpm离心20 min,取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用.7.1.4 内容物的采集与前处理采取病死或剖杀猪的小肠内容物,装入15 mL灭菌离心管中,按1：5倍体积加入无菌生理盐水,混匀,3000 rpm离心20min,取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用.7.1.5 粪便的采集与前处理用药匙无菌采取发病猪新鲜粪便,装入15 mL灭菌离心管中,按1：5倍体积加入无菌生理盐水,混匀,3000 rpm离心20 min,取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用.7.1.6 血液无菌采集心血,按1：1倍体积加入无菌生理盐水,混匀,转入1.
7、5 mL灭菌离心管中编号备用.7.1.7 大肠杆菌纯培养物挑取37 1824h培养的典型菌落,用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液.然后转入1.5 mL灭菌离心管中编号备用,待检.7.1.8 保存与运输采集或处理的样品在28条件下保存应不超过24 h；若需长期保存,应放置-70冰箱,但应避免反复冻融.采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,在68 h之内运送到实验室.按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识.7.2 PCR检测7.2.1 DNA提取7.2.1.1 取n个灭菌的1.5 mL离心管,其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数,对每个离心管进行编号.7
8、.2.1.2 每管加入800L DNAzol,分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各200 L,颠倒混匀后,4 12000 g离心10 min.7.2.1.3 取与7.2.1.1中相同数量灭菌的1.5 mL离心管,吸取900 L上清液转移至相应的管中,加入500L无水乙醇混匀后.7.2.1.4 4 12000 g离心5min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体,加入1mL 75%乙醇,洗涤.7.2.1.5 4 12000 g离心5 min,弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体.如此洗2次.7.2.1.6 4000 g离心10 s,用微量加样器小心将残余液体吸干,室温干燥310 min.7.2.1.7
9、 加入20 L经高压处理的水,轻柔混匀,溶解管壁上的DNA,冰上保存备用；若需长期保存应放置-70 冰箱.7.2.2 PCR7.2.2.1 PCR反应体系建立25L反应体系,按下列组分加入PCR专用离心管中：灭菌蒸馏水 17.375L10PCR Buffer 2.5L2.5mM dNTP 2LEx Taq DNA聚合酶 0.125L上游特异性PCR引物 0.5L下游特异性PCR引物 0.5LDNA 2L7.2.2.2 PCR反应条件94 预变性5 min；94 变性45 s,56 退火45 s,72 延伸50 s,35个循环；72 终延伸10 min7.2.2.3 电泳将PCR扩增产物6L与1
10、L上样缓冲液混合,点样于1 %琼脂糖凝胶含0.5g/mL溴化乙锭孔中,琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000 DNA Marker分子质量标准物,缓冲液为1TAE,以5 V/cm电压电泳25min.8 结果判定紫外凝胶成像仪下观察结果,当阳性对照出现在272 bp扩增条带,阴性对照未出现目的条带时,实验结果可作为判定依据.被检样品出现272 bp扩增条带为E.coli 核酸阳性,未出现272bp扩增条带的样品判为E.coli 核酸阴性.附录A 规范性附录试剂配制A.1 电泳缓冲液50倍A.1.1 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠EDTA溶液pH8.0二水乙二铵四乙酸二钠分析纯 18.61g灭菌双蒸水 80 mL氢氧化钠 调pH至8.0灭菌双蒸水 加至100 mLA.1.2 TAE电泳缓冲液羟基甲基氨基甲烷分析纯 242 g冰乙酸 57.1 mL0.5 mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液 100 mL灭菌双蒸水 加至1000 mL用时用灭菌双蒸水稀释使用.A.2 1%琼脂糖凝胶 琼脂糖电泳级 1gTAE电泳缓冲液 2 mL灭菌双蒸水 98 mL微波炉中完全融化,加溴化乙锭溶液10 L._
