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1、 烟草根系常见测定指标及实验方法一、烟草根系发生特点烟草根属直根系，由主根、侧根和不定根三部分组成。烟草由苗床栽入大田后，主根受人为控制，经常萎缩，而侧根和不定根迅速发展成一庞大根群。1级、2级侧根的增长及根长密度在时间、空间上的动态变化与其地上地下关系的变化是一致的。烟草的根系数量的增加和活力的提高存在双峰现象：第1次出现在团棵期至旺长期。移栽后40d前(团棵期)，烟草的生长中心在地下部，根系生长迅速，并且所形成的根分布在较浅的土层中。旺长期，生长中心从地下部转移到地上部，010cm土层出现了大量不定根，因此010cm内1级、2级侧根根长密度表现为增长趋势。而其它各土层内由于物质供应的减少，
2、根长密度表现为缓慢增长，甚至呈下降的趋势；第2次出现在打顶后的圆顶期。圆顶期，由于打顶使根系生长又出现一次高峰，各土层1级、2级侧根根长密度均表现出增长的趋势。因此打顶具有诱发侧根数量的增加和活力提高的作用。到后期，随着烟叶的逐渐成熟，根系开始死亡，根系生长速度减缓，根长密度变化不大。烟草生育后期下层分枝密度减少，下层较细的侧根有机物质供应不足，导致衰老死亡而出现的相对减少。二、衡量根系的指标1、 根系生物量根鲜重在植物营养研究方面很有应用价值。养分吸收大多用根鲜重作参量。根鲜重容易测定，但准确程度与根外粘附水分有关，故受操作影响较大。根干重对于养分和水分吸收不是个理想的参数，因为老而粗的根所
3、占的重量很大，而吸收养分和水分的能力很小。但当了解植物地下部的生产力时，干重常作为估计的标准。在估算根冠比（R/S）时，也要用根干重。测定根干重一般采用烘干重量法。根系干重和鲜重：烟草根系从土壤中挖出、洗净后，用吸水纸或滤纸吸干根表面水分，用电子天平称取根鲜重。获得鲜重数据后装入牛皮带放入烘箱内，在80下烘干，称其干重。2、 根系形态根系形态特征包括根系体积、几何形状、长度、分布深度、根密度、分枝状况、根重、根表面积、根毛数量和根尖数等。根系形态与养分、水分的吸收能力有密切关系。在植物营养研究中，常用的根形态参数主要有根长、根表面积、根体积、根直径等。2.1根数：根基部的根数。在洗净根系去掉地
4、上部分后，先数基部的根数。2.2根长：每个根的长度累计为根长度。在平整桌面上用铅笔画上1米的长度然后倒少量水保持浅水层，将湿根置于上，把根拉直，累计每条根的长度，得到样品的总根长。2.4 根粗：随机选取10个根，在有少量水的桌面上紧密排成一排，并用小刀修齐顶端。用小尺测量十个根的粗度，并记录下来。表1不同根茎根系粗细划分直径（mm）0.50.5-2.02.0-5.05.0-10.010.0-20.020.0粗细分类很细细小中粗很粗2.5根体积：根系体积的测定一般采取排水法测定，因为根系的体积等于其所排出同体积水的量。取1L的量筒，（具体的量筒规格根据样品的根系大小而定）。注入500ml左右水，
5、记下量筒读数。用滤纸吸干洗净的根系表面的水，揉成团放入量筒内，用玻棒将根系全部沉入水里，再次记下量筒读数，两次之差即为样品根体积。2.6根系表面积：根据根系对某种物质的吸附量来测定根的吸收面积。一般常用甲烯蓝作为被吸附物质，其被吸附的数量可以根据供试液浓度的变化用比色法准确地测出。当根系在甲烯监溶液中已达吸附饱和而仍留在溶液中时，根系的活跃部分能把原来吸附的物质吸收到细胞中去，因而可继续吸附甲烯蓝。从后一个吸附量可求出活跃吸收面积。2.7比根长：衡量根直径的重要参数之一，比根长值越大，说明根越细小。根系长度和根干质量的比值为比根长，单位为mg-1。2.8根/冠比（R/S）：是地下部与地上部干重
6、的比值，即：R/S根系干重/地上部干重R/S是描述根系与地上部生长相互关系的参数，通过测定根/冠比，可以了解植物地下部与地上部的分布及二者之间的关系。一般地SR，故R/S1。在缺磷情况下，R/S增大。植物根系的生长具有“趋肥性”，即根系能够迅速伸展到土壤养分相对丰富的地方，以扩大吸收养分的X围。在一定的土壤养分含量X围内，养分含量偏低，促进根系伸展而抑制地上部生长，R/S比较大；反之，养分含量偏高，根系较短，促进地上部生长，R/S比下降。3、 根系活力与酶活性根系活力需要用挑取足量新鲜根系洗净，放入冰盒或液氮内带回实验室，-80冰箱内保存备用。3.1 根系活力采用-萘胺法或者氯化三苯基四氮唑（
7、TTC）还原法测定。3.2 丙二醛（Malondialdehyde，MDA）植物在逆境或衰老条件下，会发生膜脂的过氧化作用。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化产物之一，其浓度表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度，所以丙二醛是逆境生理指标。通过测定丙二醛的多少可以直接作物的受逆境压迫的程度。含量采用硫代巴比妥酸法测定。3.3 根的阳离子交换量植物根系的阳离子交换量（cationexchangecapacity，简称CEC）是指每1000g干根所能吸收的全部交换性阳离子的厘摩尔数（cmol(+)/kg），是根系的重要生理生化指标之一。其大小与植物种类、品种、根细胞壁果胶的羧基含量等有关。三、实验方法1、
8、根系活力（-萘胺法）一， 测定的意义及原理：植物的根系能氧化吸附在根表面的-萘胺，生成红色的-羟基-1-奈胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色。根对-萘胺氧化能力与其呼吸强度有密切关系，日本人相见、松中等人认为-萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力愈强，对-萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可以根据染色深浅定性的判断根的活力。-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，可供比色测定-奈胺含量。二，药品：（1）40ppm（ug/ml）-萘胺溶液：精确称取0.10g分析纯-萘胺，先用2ml95%酒精溶解，加约50ml蒸馏水移入100ml容量瓶中，然后稀
9、释至刻度，保存于棕色瓶中，置于低温暗处保存。用前稀释25倍（40ml稀释至1000ml）即为40ppm溶液。（2）对氨基苯磺酸溶液：称1对氨基苯磺酸溶于100ml30%乙酸（醋酸）中。（3）100ppm亚硝酸钠溶液：称0.10g亚硝酸钠溶于1000ml蒸馏水中。（4）0.067mol/LpH7.0磷酸缓冲液分子量0.067mol PH7.0(1000ml 磷酸缓冲液)所需量（）a2HPO4.2H2O 178.05 7.1184g a2HPO4.12H2O 358.22 14.4004g KH2PO4 136.09 3.6292g a2HPO4.2H2O 7.1184g (或a2HPO4.12H
10、2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g 定容到 1000ml 容量瓶中。三，方法与步骤：(1)-萘胺标准曲线的绘制：用40ppm-萘胺溶液配制成0、5、10、20、30、40ppm各浓度-萘胺的配制：用40ppm溶液配制混匀，置室温（2025度）下分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为25ml,摇匀，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，以对照光密度为，读取光密度，以-萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。(2)将待测根系吸净吸干附着水称取1g放入100ml三角瓶中，加40ppm的-萘胺溶液和磷酸缓冲液各25ml，混匀。(3)静置5-10分钟后（根吸附以完毕
11、），从瓶中取2ml溶液放入25ml容量瓶。将其余的溶液塞好瓶塞后，放在震荡器上，在25下震荡3-6小时（如无震荡器时要在反应期间，定时的摇动），反应时间完毕后，再取2mL溶液放入另一刻度试管，因为-萘胺溶液会自动氧化，所以要同时做无根的同样操作的空白试验（根样最好用整根；用切碎的根，-萘胺溶液的氧化量会意外增加）。(4)在上述两次及空白试验所吸取的2ml测定液中，各加入10ml蒸馏水，混匀后再加入1%对氨基苯磺酸1ml和100ppm的亚硝酸钠溶液1ml，混匀，置于室温下5分钟使之显色，然后加入蒸馏水，使整个容积为25ml，在20-60分钟内用510nm波长进行比色，读取光密度，由标准曲线查出-
12、萘胺含量。也可以将根系烘干，以干重计算根系活力（更为准确些）。(5)结果计算根系对-萘胺的生物氧化量Y（ug.g-1.h-1）按下式进行计算Y=（A-B）-（C-D）*E/（t*W）式中：A-第一次取液测定值（ug.ml-1），作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶促反应；B-第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如3小时）剩余的-萘胺浓度（ug.ml-1）。A-B即-萘胺氧化总量；C-第一次空白测定值（ug.ml-1）；D-第二次空白测定值；C-D即-萘胺自发氧化量；E-稀释倍数24（48/2）（因从48ml中又取2ml）；t-3小时；W-样品鲜重（也可以用干重计算）；2、根系活
13、力（TTC法）一、原理氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素，溶于水中成为无色溶液，但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲（TTF），如下式：生成的三苯甲（TTF）比较稳定，不会被空气中的氧自动氧化，所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体，植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性，并作为根系活力的指标。二、实验材料、试剂与仪器设备（一）试剂1.乙酸乙酯（分析纯）。2.次硫酸钠（Na2S2O4，分析纯），粉末。3.1TTC溶液：准确称取TTC1.0g，溶于少量水中，定容到100mL
14、。用时稀释至需要的浓度。4.磷酸缓冲液（1/15mol/L，pH7.0）。5.1mol/L硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55mL，边搅拌边加入盛有500mL蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000mL。6.0.4mol/L琥珀酸：称取琥珀酸4.72g，溶于水中，定容至100mL即成。（二）仪器设备小烧杯3个，研钵1个，移液管：0.5mL1支、10mL1支、5mL3支，刻度试管6支，分光光度计，分析天平（感量0.1mg），电子顶载天平（感量0.1g），温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。三、实验步骤1.定性测定（1）配制反应液把1TTC溶液、0.4molL的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混
15、合。（2）把根仔细洗净，把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中，倒入反应液，以浸没根为度，置37左右暗处放13h，以观察着某况，新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色，表明该处有脱氢酶存在。2.定量测定（1）TTC标准曲线的制作取0.4TTC溶液0.2mL放入大试管中，加9.8mL乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇匀，则立即产生红色的TTF。此溶液浓度为每毫升含有TTF80g。分别取此溶液0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL置10mL刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20g、40g、80g、120g、160g的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参比
16、，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4TTC溶液和磷酸缓冲液（pH7.0）各5mL，使根充分浸没在溶液内，在37下暗保温12h，此后立即加入1mol/L硫酸2mL，以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。（3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯34mL，充分研磨，以提出TTF。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤23次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10mL，用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参比测出吸光度，查标准
17、曲线，即可求出TTC还原量。四、结果计算根系活力=C/(1000*W*h)mgTTF/（gh）式中：C四氮唑还原量，g。W根重，g。h时间，h。3、丙二醛（MDA）含量测定一，测定丙二醛的意义植物在逆境或衰老条件下，会发生膜脂的过氧化作用。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化产物之一，其浓度表示脂质过氧化强度和膜系统伤害程度，所以丙二醛是逆境生理指标。通过测定丙二醛的多少可以直接作物的受逆境压迫的程度。二，丙二醛的测定原理丙二醛是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温条件下，可以与硫代巴比妥酸（ABA）反应生成红棕色的三甲川，其最大吸收波长在532nm。但是测定组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的
18、是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm处，532nm处也有吸收。因此测定组织中MD-TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。三，仪器设备紫外可见分光光度计（或普通分光光度计）；离心机；水浴锅；研钵；10cm试管。四，操作步骤1.10%的三氯乙酸（TCA：无色结晶，易燃）溶液的配制：称取100g三氯乙酸，用蒸馏水溶解定容至1000ml。2.0.6%硫代巴比妥酸（TBA：微黄色或微粉红色结晶）溶液的配制：称6g硫代巴比妥酸，溶于约400ml煮沸的蒸馏水中，另称取100g三氯乙酸用30ml左右蒸馏水溶解后倒入硫代巴比妥酸中，冷却至室温下定容至100ml。3.MDA的提取：
19、称取剪碎的叶片（衰老或逆性环境下的叶片）1g，加入10%TCA2ml和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆以4000rpm离心10min，上清液为样品提取液。4.（1）空白：取3ml10%TCA于10ml试管中，加入3ml0.6%TBA，混合后于沸水浴上反应15min，冷却后离心（4000r，10min），取上清液调零、调百。（2）显色反应和测定：吸取离心的上清液3ml加入3mlTBA溶液，于沸水浴反应15min，冷却后离心，取上清液测定532、600、450波长下的消光度。五，结果计算与分析MDA（mol/L）=6.45*（D532-D600）-0.56D450然后以材料
20、的鲜重（FW，干重为DW）表示丙二醛的含量：MDA。本实验中，提取液总量为10ml，即10ml中为1g鲜样。最后MDA含量为：MDA=6.45*（D532-D600）-0.56D450/100*样品重量（因为样品是10ml，而MDA的量是每L，所以上公式需要除以100）六，实验结果偏离的原因分析及其注意事项。1，尽量取直接称量，避免冰箱保存后由于水汽冷凝造成的称量误差。2，研磨过程中要尽量避免TCA的损失，努力保证10提取液的分量。3，TCA易燃，具有腐蚀性，实验过程中或玻璃仪器清洗过程中避免直接与皮肤和衣服接触，否则会发生严重皮肤脱皮现象。4、根的阳离子交换量（一）样品的采集与处理1选择有代
21、表性的植株，将根系连同土壤一起掘出。先用水冲去大部分土块，然后放在筛子上（孔径0.5mm），用流水结合轻微振动将根系洗净，并注意保证根系的完整。2洗净的根立即放在80的烘箱中（预先使烘箱温度升高至90）保持恒温，烘810小时至干。3趁热将样品放入粉碎机中磨碎，并全部通过0.51.0mm筛孔过筛,然后将样品充分混合,务必使样品均匀。（二）测定1.H根的制备：（1）准确称取0.1000克(双子叶植物)或0.2000克(单子叶植物)样品放入250ml的烧杯中。（2）在样品中加几滴蒸馏水使其湿润，防止加入HCl后样品飘浮，影响测定结果。待样品完全湿润后，加入0.1mol/LHCl20ml，用玻璃棒或电
22、磁搅拌器搅拌5分钟。（3）待样品沉降后，将上部清液通过铺有慢速度定量滤纸的漏斗除去，将样品留在烧杯中，用蒸馏水多次洗涤样品，并移于漏斗上，继续用蒸馏水洗至无Cl-为止（用AgNO3检验，一般约需用蒸馏水300ml），即为H-根（若下一步骤采用添加指示剂的滴定方法时，应同时做一空白试验）。H-根可以在湿润状态下，保持在第二天测定，一般最好当日结束。（4）将洗好的样品连同漏斗，移至250ml烧杯中，将滤纸戳穿，用200ml1mol/L的KCl把全部样品洗入烧杯中。洗毕，把烧杯放在电磁搅拌器（或用玻璃棒）上不断搅拌，这时可选用下面的一种方法进行滴定操作。2.滴定操作：（1）用玻璃电极测定KCl悬浊液
23、的pH，并用0.01mol/L的KOH滴定至pH=7，全部滴定操作在5分钟内完成。（2）往装有KCl悬浊液的烧杯中滴入中性红溴百里酚蓝混合指示剂10滴，然后用0.01mol/L的KOH滴定至溶液颜色成蓝绿色，同时进行空白滴定。（三）计算：四、试剂的配制：（一）0.1mol/LHCl：吸取比重1.19的浓盐酸8.3ml，稀释定容至1000ml。（二）0.01mol/LKOH：称取5.6110克KOH稀释至1000ml用标准酸标定。（三）1.0mol/LKCl：称取化学纯KCl74.5580克，溶解于1000ml量瓶中，用玻璃电极调节pH7。（四）3AgNO3溶液：称取AgNO33克，加水至100ml，用几滴HNO3，使其呈酸性，保存在棕色瓶中。中性红溴百里酚蓝混合指示剂：0.1克中性红和0.1克溴百里酚蓝溶于100毫升60的酒精溶液中。8 / 8
