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1、-生命科学学院噬菌体的裂解性和溶原性的基因调控机制*：*: 班级：专业:摘要噬菌体（phage）有两种生存策略，一种通过感染宿主细胞，产生大量的子代噬菌体，同时宿主细胞裂解死亡，这种方式称为裂解性感染。另一种是噬菌体的基因组以一种原噬菌体的方式潜伏于细菌中，这种增值方式称为溶原态（lysogeny）。噬菌体的裂解发育、溶原发育和溶原发育到裂解发育的诱导是研究生物分子调节优异的模型。经过四十多年的研究，在这个模型中已经发现了众多的正调节因子和负调节因子在转录水平或转录后调节基因的表达。关键词:噬菌体、裂解性、溶原性目录1.摘要22. 噬菌体的结构组成32.1壳体结构 32.2噬菌体的核心33.
2、噬菌体的生活周期63.1 噬菌体DNA复制63.2噬菌体的转录调控73.3噬菌体的溶原性感染 93.3.1噬菌体溶原化状态的建立93.3.2噬菌体基因组的整合113.3.3原噬菌体的割离123.3.4裂解性-溶原性选择决定154. 参考文献161951年 Esther Lederberg 发现E.coli K12菌株经UV诱发或偶尔自发放出噬菌体。 E.coli K12中有潜伏的、无感染能力状态的噬菌体，称原噬菌体。将这种噬菌体命名为。侵染E.coli后可进入裂解周期（lytic cycle）或溶原周期（lysogeny）。2.噬菌体的结构组成2.1壳体结构噬菌体是有尾噬菌体，壳体由头部和尾部
3、组成，头部和尾部通过颈部相连。头部通常呈二十面体对称，直径为60nm左右；尾部呈螺旋对称，无收缩性。噬菌体头部蛋白主要有gpE(38kD)和gpD(12kD)，他们以非二硫键进行共价连接。2.2噬菌体的核心噬菌体核心包含线状dsDNA，分子量为30.8MD，含有48502bp，其双链DNA的两5端叫做m端,末端碱基为G，为左向或反时针方向转录的链。R链或右链5端称为m端，末端碱基为A。DNA被注入到宿主细胞后，可借助两5端单链的氢键缔合和连接酶的作用形成闭合环状DNA。由于噬菌体即可进行裂解生长，也可进入溶原化状态，因此噬菌体基因组的结构是与它的这些特性相适应的，其中一些基因决定裂解生长，另一
4、些基因决定噬菌体的溶原化，甚至还有一些基因可以对这两种状态的转变行使调节作用。噬菌体基因组DNA总长度为48502bp，呈线状，当其DNA进入细胞后和基因进行转录时则呈环状。根据DNA的环状结构，可将66个可编码的基因分成3个功能区(functional block)：右边的功能区参与衣壳形成和DNA复制，称为右操纵子区；左边的功能区与裂解生长和溶原化功能有关，*c 称为左操纵子区，中央功能区是基因组调控操纵子区，也称为免疫操纵子区。左图为噬菌体的基因图。（1）右操纵子区 A至J为构成衣壳蛋白的基因，其中S、R基因与裂解作用有关。O、P为DNA复制基因，与复制原点(ori)靠近，Q为抗终止因子
5、基因。（2）中央调控操纵子区 cI为阻遏物基因，其基因产物是噬菌体基因组早期转录的阻抑物；cro为操纵基因OL和OR的阻抑物基因，其蛋白产物通过OR可抑制左向cI基因的转录。c基因产物能激活cI和int转录，与噬菌体进入或维持溶原化状态有关。（3）左操纵子区 N是抗转录终止基因，N基因产物能拮抗早期转录终止子tR1、tR2和tL1、tL2，使PL和PR的转录作用各自越过终止子区而继续向左和向右进行延伸转录。e*o和bet是位于red区域的两个基因，常被称为red基因，red为重组相关的基因，其基因产物为核酸外切酶，参与裂解生长早期所发生的重组，并能使DNA的型复制转变为滚环复制。Gam为大肠杆
6、菌外切核酸酶V的抑制物基因，gam基因产物可使宿主recB和recC基因编码的外切核酸酶失活，而外切核酸酶V则降解由滚环复制所产生的线状多联体DNA。int是整合酶基因，int基因产物能识别宿主细胞染色体DNA和噬菌体基因组上相应的att位点，并能催化二者的断裂和再连接。Att位点称为附着位点，在宿主细胞DNA上称为attB，在噬菌体DNA上称为attP, attB和attP位点分别有一段由15bp组成的同源核苷酸序列，借助同源性重组作用可使噬菌体基因组插入到宿主的染色体DNA上。*is为切除酶基因。Int和*is基因产物共同作用，能使att位点发生重组，并将原噬菌体基因组DNA从宿主染色体中
7、切割下来，使噬菌体进入裂解过程。在左区还有一个c基因，它的基因产物可行使c样的功能，即激活cI和int的转录。在b2区域内的一些基因不是噬菌体存活和感染所必需的，它们包括DNase、膜蛋白基因和int基因表达的调节位点。从噬菌体整个基因组来看，相邻基因之间的终止位点和起始位点常发生重叠。如在ATGA序列中，TGA是前一个基因的终止密码子，而ATG则是后一个基因的起始密码子，像这样的重叠结构，噬菌体基因组中就有30个，整个基因组很少有非编码区。表1噬菌体主要的调节元件及调节基因产物的功能调节元件或调节基因产物及功能PL,OL,PR,OR左右向转录的启动子和操纵子tR(1,2,3,4,5)右向转录
8、的终止子tL(1,2)左向转录的终止子PREC蛋白建立启动子，受C蛋白调控PIint基因启动子，受C蛋白调控PaQQ蛋白反义RNA启动子，受C蛋白调控PRMC蛋白基因维持启动子，受C浓度调控PR晚期转录的启动子nutL,nutRN蛋白左右两个反终止结合位点qutQ蛋白反终止结合位点croPL和PR的阻遏蛋白，并可阻遏PE，抑制CI表达cIPL和PR的主要的阻遏物，并可自主调控PRMc可以启动PRE、PI和PAQ，使进入溶原化途径c和C组成复合物，启动PE产生c及cro的反义RNANtR1,tR2及tL1的反终止蛋白QtR4的反终止蛋白.O, PDNA复制所需的蛋白S,R,R2裂解宿主所需的裂解
9、酶int整合酶，使整合到宿主的染色体中*is切除酶，帮助在att位点和宿主连接bet, e*o重组蛋白，帮助和宿主进行重组W,B,N u3,C,D,E,F,F,Z头部蛋白基因U,V,G,T,H,M,L,K,I,J尾部蛋白基因cos(cohesive)12bp的回文序列，由线状连接成环状的连接点，A蛋白切割位点A末端酶，识别cos位点，包装时将环连体切成单个的基因组3. 噬菌体的生活周期3.1 噬菌体DNA复制噬菌体DNA复制分为早期复制和晚期复制。在早期和晚期复制阶段各具有不同的复制方式，早期为复制，晚期为滚环复制。（1）复制复制是从一个复制原点起始的，并且通过左复制叉和右复制叉产生双向复制。
10、复制原点的组成：噬菌体的复制原点存在于基因O区域内，由三个部分组成：一是4个高度保守的同向重复序列，由19bp组成，被称为ori重复序列；二是大约为40bp组成的AT富含序列，其中AT占80；三是28bp组成的回文序列，中间不对称的部分含有4bp，见下图。复制的起始：DNA复制是从复制原点起始的，ori的DNA链解旋要有基因O和基因P产物的参与，然而基因O和基因P的转录却是通过右向启动子PR和右向操纵基因OR发动的。如果cI基因编码的阻遏蛋白结合在PR和OR上，基因O和基因P就不能进行转录，DNA复制也随之被阻断。通常基因O和基因P一旦编码形成蛋白0和蛋白P，蛋白O就可以识别和结合4个ori重
11、复序列，并且再通过蛋白P同大肠杆菌的dnaB基因编码的解旋酶相互作用，构成复制复合体，后者与蛋白O在ori部位作用，使DNA双链解旋，然后由引发酶催化合成一段引物RNA，再在DNA聚合酶的催化下启动DNA复制，从ori起始，DNA呈双向复制。值得指出的是，在复制原点部位的AT富含序列具有两个方面的功能，一是AT富含区段呼吸作用强易于使DNA解旋。二是AT富含序列易于产生 RNADNA合成的转变。DNA所进行的复制，没有固定的复制终点，当两个复制叉碰撞在一起的时候，复制便告终止。（2）滚环复制 在噬菌体进行裂解生长的晚期，早期蛋白合成关闭，衣壳蛋白和溶细胞蛋白开始合成，DNA的复制也由复制转变为
12、滚环式复制。DNA滚环复制为单向复制，故它又称为复制，由滚环复制产生的多联体线状分子经内切酶识别并切开从粘性末端cos位点，形成线状DNA分子。再经过衣壳蛋白将线性DNA分子包装在衣壳内。大肠杆菌的外切酶V能阻止噬菌体DNA滚环复制，但gam基因产物能使这种酶失活。3.2噬菌体的转录调控噬菌体基因组的转录过程较为复杂，其DNA的两条链都有各自的转录单位，r链为右向转录，l链为左向转录，一些在功能上密切相关的基因聚集而成几个大的转录单位，即4个操纵子，他们分别称为阻遏蛋白操纵子、左向早期操纵子、右向早期操纵子和右向晚期操纵子。阻遏蛋白操纵子含有cI基因，其产物cI蛋白为DNA的阻遏蛋白；左向早期
13、操纵子主要编码与重组、整合、割离有关的蛋白；右向早期操纵子主要编码与复制有关的蛋白；晚期操纵子编码头部结构蛋白，还有溶菌酶，与噬菌体的裂解作用有关。晚期操纵子是一个大的操纵子，含有20多个基因。噬菌体左右向早期操纵子并非是各自仅仅转录合成一条mRNA，而是右向早期转录操纵子转录合成3种mRNA（R1，R2和R3），左向早期转录操纵子转录合成两种mRNA（L1和L2）。噬菌体mRNA的转录终止是通过依赖于因子的终止子以及抗终止子来调控的。在左向早期操纵子中，具有一个依赖于因子的终止子tL1，宿主RNA聚合酶从左向启动子PL转录至终止子tLl，产生L1mRNA；在右向早期操纵子中具有两个依赖于因子
14、的终止子tR1、tR2和一个对于抗终止作用不敏感的终止子tR3，大肠杆菌聚合酶从右向启动子PR开始转录合成R1mRNA。L1mRNA为基因N转录产物，R1mRNA为基因cro的转录产物，这两个基因均称为极早期基因，而两个左右早期转录操纵子的其他基因称为延迟早期基因。蛋白N能阻止终止子tL1、tR1和tR2的终止作用，而使延迟早期基因得到表达，转录生成L2、R2、R3三种mRNA,其中L2和R2mRNA编码合成与cI基因表达密切相关的C和C蛋白，以及DNA复制所需的0和P蛋白；R3mRNA翻译合成Q蛋白。3.3噬菌体的溶原性感染噬菌体除了能产生裂解繁殖外，它的基因组还可以被整合到宿主染色体DNA
15、上，并且长期存在于宿主细胞中。整合后的噬菌体基因组能随宿主DNA一起复制，当细菌分裂产生子代细胞时，其子代染色体DNA中都带有整合的噬菌体基因组，这种噬菌体基因组的整合作用就称为噬菌体的溶原化（lysogenization）。染色体DNA上整合有噬菌体基因组的宿主细胞叫做溶原菌（lysogen）,而被整合的噬菌体基因组叫做原噬菌体（prophage）。3.3.1噬菌体溶原化状态的建立在噬菌体感染早期，宿主DNA聚合酶能识别PR和PL，并启动早期转录。基因cro依赖PR启动子进行转录，其转录产物编码合成Cro阻遏蛋白，Cro蛋白是一种DNA结合蛋白，能结合于OL和OR的CI阻遏蛋白结合部位，Cr
16、o蛋白通过结合于OR中的OR3而干扰RNA聚合酶从PRM起始基因cI的转录。然而，就在基因cro转录的同时，一种依赖于PL启动子的基因N也已开始转录和合成N蛋白，由于N蛋白的抗终止作用，导致基因c和c的转录，编码合成c和c。在c和c蛋白的共同作用下，RNA聚合酶转而识别抑制建立启动子PRE，PRE左向启动转录，其转录方向与基因cro依赖PR启动子的转录方向正好相反，而且转录作用经过基因cro一直延伸到基因cI，结果转录产生cImRNA和cro mRNA，并分别编码产生cI蛋白和Cro蛋白。CI蛋白是一种DNA阻遏物，它同Cro蛋白一样能结合操纵基因OL和OR，阻止OL和OR的转录。OR是右向转
17、录的关键性操纵基因，它决定着噬菌体是进入裂解生长，还是进入溶原化状态。在OR中有3个阻遏蛋白的结合位点，分别称为OR1、OR2和OR3。OR1、OR3分别与PR和PRM相邻接，cro蛋白大多与OR3结合，CI蛋白主要结合于OR1和OR2。由于CI蛋白同OL和OR的结合，阻止了从OL和OR的起始转录，因而导致左向基因C 和右向基因C以及cro的转录被CI蛋白所阻遏。这样一来，基因c和c就不再编码对启动子PRE行使正调节作用的蛋白产物，使基因cI依赖于PRE启动转录也随之被阻遏，但通过CI蛋白结合OR1和OR2，抑制了cro基因转录以及Cro蛋白的合成，结果导致CI阻遏蛋白维持启动子PRM被激活，
18、使CI蛋白能得以持续合成。噬菌体裂解生长与溶原化的建立取决于两种阻遏蛋白CI和Cro的合成。当CI蛋白的合成占优势时，PRM被激活，CI蛋白继续起始合成，因而溶原化状态建立。相反Cro蛋白合成占优势，则PRM被抑制，没有CI蛋白的合成，于是噬菌体在Cro蛋白的控制下进入裂解生长。3.3.2噬菌体基因组的整合当CI蛋白比Cro蛋白的合成占优势而引起溶原化状态建立后，DNA既不能进行复制，也不能进行滚环复制，而是插入到宿主细胞染色体DNA上，并且随着宿主DNA的复制平均的分配到子代细胞中去。由于在噬菌体感染的早期，c和c蛋白的合成，不仅导致CI蛋白产生，而且也激活了基因int所依赖的Pi启动子的转
19、录，编码产生整合酶。当噬菌体处于溶原化状态时，尽管CI蛋白抑制了左向和右向大多数基因的转录，但因Pi对CI蛋白的作用不敏感，所以基因int仍能够产生低水平的表达。基因int编码的整合酶能识别细菌附着位点和噬菌体附着位点。attB位于宿主基因gal和bio之间，由25bp组成，attP长约240bp。在attB和attP的位点上都含有相同的核心序列，称为O区，该区由15bp组成：5GCTTTTTTATACTAA33CGAAAAAATATGATT5Int噬菌体的attP由P、O、P3个序列构成，大肠杆菌的attB则包含B、O、B3个序列组分，attP和attB除了在O区的序列完全一致外，P、P、B
20、、B各个序列之间是完全不同的，O区是attP和attB发生重组的位点，这一重组过程需要整合酶催化，但整合酶必须首先与宿主编码的宿主整合因子结合形成复合体，才能催化attP和attB在O区进行重组而形成原噬菌体。在原噬菌体的左边是attL（BOP），右边是attR（POB），其整合反应可写成：原噬菌体细菌噬菌体HifBOB+ POP BOP+ POB经过二者的重组作用，噬菌体基因组被插入到宿主的染色体DNA上，整合后的原噬菌体基因组排列顺序也由裂解生长时的A-J-N-CI-R转变为N-CI-R-A-J。进入溶原化的原噬菌体往往只产生CI蛋白的合成，并以此来维持噬菌体的溶原状态。然而，CI蛋白的合
21、成表现为自我调节，当CI蛋白浓度低时，他催化启动子PRM的活性以维持产生CI蛋白。而当CI蛋白浓度过高时又会抑制PRM的转录作用。3.3.3原噬菌体的割离噬菌体基因组被整合到细菌染色体DNA上的作用是可逆的，当CI蛋白的作用受到抑制时，被整合的原噬菌体经过切割，其DNA又可离开细菌染色体而游离出来，恢复他的裂解性生长。这一作用要求基因int、*is以及宿主编码的Hif蛋白的参与。由于整合酶在噬菌体整合过程中的两个作用底物是噬菌体DNA和细菌DNA的附着位点，即BOB和POP位点，整合酶只能催化BOB和POP之间的交换重组。然而，原噬菌体切割是整合过程的逆反应，其作用的底物则是attP和attB
22、重组后产生的BOP和POB，这一切割过程不仅需要整合酶，Hif，而且还需要另一个邻近int的*is基因的作用。通过基因*is编码产生的切割酶与整合酶结合构成复合体，该复合体具有结合BOP和POB的能力，并且可以促使二者进行相互交换和重组，结果导致重新形成游离的环状DNA分子。原噬菌体基因组的切割反应还可能与宿主编码的一种反向刺激因子（factor for inversion stimulation,FIS）有关，FIS在POB上的特异结合位点与*is的结合位点是重叠的，并且能够同*is一起结合到这个位点上,当*is蛋白浓度适宜时，FIS能够提高切割重组20倍。但在*is蛋白浓度处于饱和状态下，
23、FIS不起作用，而当FIS浓度过高时，则可产生非特异性的结合，阻止切割反应。然而应该指出的是，基因*is是通过启动子PL进行转录的，而PL在溶原状态下受到了CI蛋白的阻遏，结果使基因*is不能表达。但一些诱变因子如紫外线辐射，丝裂霉素对宿主DNA造成的损伤，可激活一个SOS修复系统。这个修复系统含有大约20个基因，其中研究的最为清楚的是基因recA和Le*A。SOS系统在大肠杆菌细胞处于正常情况下是关闭的，这一修复系统的关闭是通过基因Le*A蛋白的功能来实现的，Le*A蛋白是一种阻遏蛋白，它的活性可受到基因recA产物的调节。recA蛋白具有3种主要的生物活性：一是重组活性，二是单链DNA结合
24、活性，三是蛋白酶活性，它在正常细胞内是行使同源重组的功能，而当DNA出现损伤时，recA蛋白可结合于DNA因损伤而产生的单链区域，并且以一种蛋白酶的活性形式作用于Le*A蛋白Ala-Gly之间的肽键，使之水解失活。同样recA蛋白酶在溶原菌中也可水解CI阻遏蛋白，随着CI阻遏蛋白的生物活性丧失，基因*is以及其他与裂解生长有关的基因不再受到抑制，于是噬菌体结束溶原周期而进入裂解周期，引起宿主细胞的裂解。除此而外，一些cI基因温度敏感的突变株，当他们处于温度为30到32的条件下，基因cI能进行正常表达，合成CI蛋白。而一旦温度上升到42时，cI基因不能再编码合成CI蛋白，原噬菌体基因组也会从宿主
25、染色体DNA上切割下来，并释放到细胞内，重新恢复裂解生长。当一个溶原的Hfr细胞与一个非溶原的F-细胞结合时，也能产生结合子诱导，此时原噬菌体因被引入到一个无CI阻遏蛋白的F-细胞中也会发生割离。3.3.4裂解性-溶原性选择决定在噬菌体感染宿主细菌1015分钟后就要做出裂解性-溶原性选择决定。人们认为细胞生理学状态影响这个选择决定的结果，但是详细机制还不清楚。正如前面所提到的，这种选择决定依赖于激活蛋白C的水平。如果C水平高，则C指导CI阻遏物的高水平表达，被感染的细胞则进入溶原性途径。如果C不存在或水平低，则细胞进入裂解性途径。似乎有几种不同的因子控制着C的水平。第一，C不稳定，它可以被细菌
26、的蛋白酶HflB或FtsH降解。由于FtsH是一种膜结合蛋白，其生化分析一直是难题。似乎是由细胞生理学状态调节FtsH活性的。已经知道细胞饥饿、在贫瘠的培养基中生长、在低温下生长等都有利于形成溶原性状态，但是这些影响因子与C水平之间关系的机理还不清楚。第二，FtsH活性还可能被第二种噬菌体蛋白C调节，它显然是充当HflB的竞争性抑制剂。因此高水平的C可以稳定C。第三，PL和PR启动子分别控制C和C的表达。因此他们是在感染过程中的早期得到表达的。被几个噬菌体同时感染的细胞更有可能进入溶原性途径，对此人们认为是由于基因剂量效应引起的。基因剂量效应导致了较高水平的C和C表达。第四，其他的细胞蛋白明显
27、地影响着裂解性-溶原性选择决定的结果。突变hflK、hflC或hflD也导致高频率的溶原化。HflKC复合体也是膜结合蛋白。相反的lon突变（编码一种非特异性的依赖ATP的蛋白酶）或crp突变（编码激活蛋白CRP或称CAP），都能关闭溶原性应答。这些突变体影响裂解性-溶原性选择决定的机制还了解甚少。参考文献：1. 分子病毒学*耀先、周晓峰等编著.*科学技术 20002. 噬菌体-在致病机理及生物技术中的作用美M.K.沃尔德、D.I.弗里德曼、S.L.阿迪亚 主编.艾云灿、孟繁梅 主译.20073. Molecular Biology of the Gene, 6th Ed., J.D.Wast
28、on, T.A.Baker, S.P.Bell, A.Gann, M.Levine & R.Losick, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 20084. Lewin B.著, 余龙等译 基因 . 科学，2005，5. lan B. D. et. al. Revisited gene regulation in bacteriophage . Curr. Opin. Genet. Dev. 15:145-1526. Ma* G. Bacteriophage : The Untold Story. J. Mol. Biol. 1999, 293: 177-
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