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1、基于硝基还原酶的荧光氧探针摘要：硝基还原酶在细胞低氧条件下大量存在,利用其对硝基化合物的催化还原性能,不仅可以用于药物的激活和硝基芳香族化合物的生物降解,同时也可用来设计含硝基的荧光探针,用于检测实体瘤细胞的缺氧状况,并对低氧环境下的肿瘤细胞进行生物成像,这对临床治疗、增强机体代偿适应能力都有重要意义。关键词：硝基还原酶；荧光；氧探针Fluorescent Oxygen Sensor Based on Nitro ReductaseAbstract:Nitrate reductase is found in the cells under the condition of low oxygen
2、 concentration with large Number.With the ability of catalytic reduction of nitro compounds, it not only can be used for drug activation and biodegradation of nitro aromatic compounds, but also can be used to design fluorescent probe for detectingthe anoxic condition of solid tumor cells, and imagin
3、g the tumor cells living hypoxia environment, which are quite important for clinical treatment and enhancing the body compensatory ability ofaccustomization.Key words: nitrate reductase; fluorescent ; oxygen sensor1 引言氧气是生命体的必需元素,人可以一个月不吃东西,两个礼拜不喝水,但是不能10分钟不呼吸氧气。生命体中,氧气的含量至关重要：富氧会产生大量的自由基,使机体组织损害,器官
4、退化,免疫力下降；缺氧一开始会导致头晕眼花、然后呼吸急促、丧失判断力,严重一些就会丧失智力、晕厥,最严重可致死。同时,低氧是实体肿瘤微环境的典型特征之一,它在实体肿瘤中普遍存在,被认为是导致肿瘤进展及预后差的独立因素。低氧诱导生物学行为的改变加速了肿瘤恶性转变,如抑制细胞增殖、增强耐药基因表达、选择性抗凋亡、促进肿瘤侵袭转移、下调DNA修复基因表达及增加基因的不稳定性。众多研究表明低氧具有调控癌细胞分化能力,它通过促进肿瘤干细胞生成及表观遗传修饰,从而增强肿瘤恶性潜能。因此,通过检测细胞中含氧的浓度,利用肿瘤细胞的低氧性,我们可以对癌细胞特异性的靶向诊断和治疗。由此,研究人员设计发展了一系列检
5、测细胞中氧含量的方法。氧浓度的检测方法有传统检测法和光学氧探针法1。传统检测法中,Winkler滴定精密,但不能持续测定；Clark电极对氧有损耗,适用于室温、小体积检测；光学探测需要大型昂贵的仪器,同时水、二氧化碳分子等对检测都有干扰。而相较之下,光学氧探针检测过程可实现无氧损耗的可逆过程,检测结果精密、准确,对细胞无创伤,在生物体中可以实现远程传感并组织区域成像。近些年,光学氧探针得到了迅速发展。在光学氧探针体系中,发展了通过检测低氧环境下的硝基还原酶的含量来检测细胞中的氧含量的硝基还原酶荧光氧探针。生物体中存在大量的酶,其中有一类硝基还原酶,它可以将硝基化合物催化还原为羟胺或氨基化合物。
6、硝基还原酶可以激活硝基类药物,使其产生细胞毒性。同时,在细胞低氧条件下,硝基还原酶大量产生,利用硝基还原酶催化还原硝基化合物的这一特性,可以设计含硝基的荧光探针。根据不同的荧光响应机理,可以实现Turn-on、Turn-off和比率计型荧光探针,用于检测实体瘤细胞的低氧性,并对低氧环境下的肿瘤细胞进行生物成像。这一检测方法具有简便、高灵敏度和高时空分辨能力等特点,在临床治疗、增强机体代偿适应能力等方面具有重要意义。本文将简要介绍利用硝基还原酶来设计荧光探针检测细胞低氧性的基本发展概况。2 硝基还原酶的结构及其还原机制硝基还原酶2是一类依赖于黄素单核苷酸flavin mononucleotide
7、, FMN或黄素腺嘌呤二核苷酸flavin adenine dinucleotide, FAD的细胞质酶,它可以利用NADH实现硝基芳香族化合物和硝基杂环衍生物的还原代谢。硝基还原酶通常以不对称同源二聚体的形式存在,其二聚体交界面处结合有两个FMN辅助因子,其结构如图1。图1 大肠杆菌硝基还原酶的晶体结构硝基还原酶在催化硝基还原的过程中遵循的是乒乓机制。由于FMN的si面被刚性的链占据,没有空间容纳其他分子,而re面暴露于溶剂中,提供了底物结合的空间,即仅有re面上可发生氧化还原反应,但受到空间大小的限制而不可能同时结合两个底物。因此,电子供体NADH首先进入活性口袋,将C4原子上的质子、电子
8、传递给FMN,而自身被氧化为NAD+,从酶上解离。随之反应底物与酶结合发生质子、电子转移生成相应的产物,最后产物从酶分子上脱离。硝基化合物在酶的催化作用下,经亚硝基中间产物还原生成相应的羟胺或氨基衍生物,其催化机制如图2。图2 硝基还原酶的催化机制3 细胞低氧性低氧是指可利用氧的减少或氧分压降低至临界值以下的状态,这种状态会限制,甚至会终止器官、组织和细胞的生理功能。低氧是恶性肿瘤发生、发展过程中普遍存在的现象,其产生主要与肿瘤细胞无限制生长、氧耗量增加、血氧供应不足及肿瘤组织血管发育不良等有关3,也是临床多种疾病共有的病理过程。低氧环境下的肿瘤细胞易发生转移,并且能增加对放疗、化疗的抗拒性,
9、从而降低了治疗效果。因此,研究低氧的发生和发展规律,对临床治疗、增强机体代偿适应能力都有重要意义。肿瘤细胞缺氧通常可以导致细胞内的硝基还原酶的增加,测定生物体系中硝基还原酶的含量,可以间接检测细胞的低氧性,及判断肿瘤细胞的增殖状态。因此硝基还原酶可以作为衡量细胞或生物体缺氧状态的重要指标。4 基于硝基还原酶的荧光探针基于硝基还原酶的荧光探针通常是在荧光体中设置或引入硝基识别基团来设计的,利用生物体系中含有的内源性NADH作为电子供体,探针中的吸电子基团硝基会被硝基还原酶还原成供电子基团氨基,从而使探针分子内部产生电荷转移并导致光学信号的改变,进而实现硝基还原酶的检测。同时,联用共聚焦荧光成像技
10、术,可以对不同状态下细胞中硝基还原酶的变化进行实时观察,对低氧组织和细胞进行生物成像。根据不同的荧光响应机理,基于硝基还原酶的荧光探针可以分为Turn-on型、Turn-off型和比率计型。4.1 Turn-on型众所周知,硝基是荧光猝灭基团,当荧光发色团上连有硝基时,荧光会被猝灭。而低氧环境下,硝基还原酶将硝基还原为供电子的氨基,则荧光重新启亮,实现Turn-on型荧光信号改变。1991年,Hodgkiss等合成了芳杂环硝基化合物图3-1、24。他们将硝基连接到萘二甲酰亚胺上猝灭其荧光,当硝基被生物还原,萘二甲酰亚胺的荧光重新启亮。其后,他们合成了含有硝基咪唑的香豆素化合物图3-3、45,边
11、链可以选择性的接触细胞内的低氧成分,低分子量的二环荧光,提高了荧光的效率和亲水性,转移到肿瘤的效率提高,有助于生物成像。图3Ma等6以Resorufin为荧光母体,将5-硝基呋喃与5-硝基噻吩作为硝基还原酶的识别基团引入Resorufin中,发展了两个高灵敏度Turn-on型硝基还原酶光学探针5和6图4。选择Resorufin作为荧光体,是因为它的荧光波长较长585nm、水溶性好以及荧光可以通过7-羟基的取代而得到有效淬灭。探针5和6本身的荧光很弱且几乎无色,有利于获得低背景信号。然而在NADH存在下,两个探针的硝基可被硝基还原酶还原为羟胺或氨基,并发生1,6-重排与消除反应,从而释放出Res
12、orufin荧光体,导致溶液荧光显著增强,颜色由无色变成紫红色。这些探针对细胞中的其它内源性物质包括谷胱甘肽、半胱氨酸等还原性物质均无响应。据此构建了高选择性、高灵敏度的检测硝基还原酶的荧光分析法,同时,基于颜色的变化还可对硝基还原酶及低氧细胞进行目视检测。探针5和6已分别成功用于细胞缺氧状态以及大肠杆菌中硝基还原酶的检测研究。图4 探针5和6对硝基还原酶的响应机理大多的荧光探针都有硝基芳香环和喹喔啉团,但由于它们对低氧响应的灵敏度低,吸收和发射在短波方向,因而不适用在活的生物体内成像。20XX,Nagano等7用偶氮功能团合成了一系列的近红外探针图5-7-9。它由近红外的二碳菁和一个连有偶氮
13、官能团的淬灭剂组成。正常情况下,偶氮不能被还原,碳菁染料发生荧光共振能量转移FRET而使其荧光猝灭,低氧条件下,偶氮被硝基还原酶还原,对菁染料的发射不再吸收,FRET传递受阻,荧光增强,实现Turn-on型信号改变。这是第一个对动物活体缺血性低氧的实时荧光成像,并且快速响应,高成像质量。图520XX,Nagasawa等8发展了一种新型的基于三碳菁染料Cy7的近红外荧光探针10图6,其激发和发射波长分别为753nm和778nm,有利于肿瘤细胞活体成像。他将Cy7染料和2-硝基咪唑连在一起组成低氧靶向基团。硝基被还原后,与常氧环境相对比,低氧环境中的荧光显著增强。但是,该探针的荧光即便在常氧条件下
14、,也有强的背景荧光,这可能是因为该探针与细胞内组分的非特异性非共价键结合,或者因它的带电性和亲脂性而被细胞作为释放物排出。活体成像说明该探针能在肿瘤细胞中靶向积累,在低氧肿瘤细胞活体成像中有很好的应用前景。图64.2 Turn-off型硝基是一个强缺电子基团,在荧光发色团中,可以利用其缺电子性质,与一个供电子基团形成推拉电子体系,强烈的分子内电荷转移Intermolecular Charge Transfer, ICT会导致荧光辐射增强。而当缺电性硝基被还原为供电线的氨基,推拉电子体系被破坏,荧光猝灭。20XX,Qian等9将硝基和荧光团共轭,合成了用于细胞低氧成像的荧光探针图7-11-14。
15、11和12中,由于硝基的缺电子和氨基的给电子,形成强推拉电子体系,有强烈的ICT作用,而辐射出强烈的荧光,当硝基基团被生物还原,则荧光猝灭,实现Turn-off型荧光信号改变。而13和14中,硝基与萘共轭,ICT弱,所以硝基作为正常的荧光猝灭基,当硝基基团被生物还原后,化合物表现荧光增强,实现Turn-on型荧光信号改变。20XX,Qian等10在萘二甲酰亚胺的侧链氨基上引入N-O基团图7-15,硝基与N-O基团都与萘二甲酰亚胺共轭,低氧时,硝基被还原,拉拉体系变为推拉体系,荧光显著增强,也为Turn-on型荧光信号改变。图74.3 比率计型当发色团在与硝基还原酶反应前后有荧光信号颜色的改变,
16、可以实现比率计型荧光探针。Qian他们11用氨基甲酸酯将硝基苯和萘二甲酰亚胺相连,得到探针16。这个化合物中,氨基甲酸酯作为缺电子中心,削弱ICT,导致荧光蓝移。还原后,氨基被释放,荧光恢复,从蓝475nm到绿。这是第一个比率计荧光探针。图85. 结论在电子供体存在下,利用硝基还原酶可以选择性将硝基还原为羟胺或氨的反应,人们可以发展含硝基的荧光探针,既可以检测细胞中硝基还原酶的含量,同时也可以检测细胞的低氧性,并对肿瘤细胞进行生物成像。这在临床治疗和组织细胞研究方面具有重要意义。根据不同的荧光响应机理,基于硝基还原酶的荧光探针可以分为Turn-on型、Turn-off型和比率计型,目前以Tur
17、n-on型为主。将基于硝基还原酶的荧光探针应用于肿瘤细胞活体成像,需要探针的激发和发射处于近红外,有良好的水溶性,可被细胞分解性,无细胞毒性,对肿瘤细胞特异靶向结合性等,基于这几点,目前的荧光探针尚需进一步研究与发展,以期获得更好的生物适用性的荧光探针。参考文献：1 Xu-dong Wang and Otto S. Wolfbeis, Chem. Soc. Rev., 2014,43, 36662 白敬, 杨君, 杨青. 细菌硝基还原酶的结构与催化机制J. 生命的化学, 2013, 33: 84-90.3 Yang, Z., Cao, J., He, Y., Yang, J. H., Kim,
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