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1、2022类固醇生成因子1基因突变及其相关临床表型研究进展(全文)摘要类固醇生成因子(SF-I,NR5Al)是在性腺及肾上腺发育过程中起关键调控作用的转录因子。NR5A1基因突变是性发育异常(disordersofsexdevelopment,DSD)常见病因之一，目前临床报道的病例多为杂合突变。该基因突变患者临床表型复杂，早期报道的患者表现为不同程度的46,XY性腺发育不良，近年发现该基因突变与男性无精症或女性的卵巢早衰有关，多数患者无肾上腺皮质功能不全。目前认为患者临床表型异质性，可能与不同基因突变对转录活性的功能影响、下游靶基因(如SOX9等)基因剂量效应以及寡基因突变等的遗传背景等相关。
2、通过对NR5A1突变的基因型和相关表型开展研究，有助于人们深入理解性腺发育的过程及其调控机制。一、NR5Al分子结构特征类固醇生成因子-1,也称核受体亚家族5中的A组成员I(SterOidogeniCfactor-1/nuclearreceptorsubfamily5groupAmember1,即SFl,NR5AlAd4BP),是一种孤儿核受体。由位于染色体9q33.3上的NR5A1基因所编码，该基因包含7个外显子，其中6个有编码功能。该基因编码的核受体含有461个氨基酸，其蛋白结构是由含有2个锌指结构的DNA结合域(DBD)、A盒(A-box)、柔性较链区、配体结合区(LBD)及两个激活功能
3、域AF-I和AF-2构成1,2。DNA结合域是NR5A1结构中最保守的区域，第一个锌指结构包含P盒(P-box),可特异性识别靶基因的DNA结合位点，A-box在结合过程中起稳定作用，较链区及AF-2参与转录激活3,4。NR5A1在性腺、肾上腺、脾脏、下丘脑腹内侧核及垂体中广泛表达,是肾上腺及性腺发生过程中的关键转录因子，参与调控类固醇激素生成及，性腺发育过程中相关基因的激活1,5,6,刀。二、NR5A1的功能与其主要下游靶基因的调控人胚胎期性腺发育主要包括两个阶段，第一个阶段是双向潜能性腺的出现,人胚胎约第4周，生殖崎内面的体腔上皮细胞增殖隆起，此时原始生殖细胞迁移到该部位，形成双向分化潜能
4、性腺8。第二个阶段是双向潜能性腺分化为睾丸或卵巢的过程，若为XY胚胎，则NR5A1将维持其在双向潜能性腺中的表达，继而在GATA4、WTl等多个转录因子的协同下使SRY基因的表达升高,当SRY表达到临界阈值时,与NR5A1相互协同，作用于位于SOX9(SRY-relatedHMGboxgene)基因上游13kb处的睾丸特异性增强子核心元件(TESCo),上调并维持了S0X9基因的表达,而S0X9的表达对于促进及维持支持细胞(SertoliCeIl5。分化至关重要9,：L(U1,在睾丸支持细胞中，NR5A1的主要的下游靶基因是缪勒管抑制因子(anti-Mullerianhormone,AMH),
5、通过激活AMH基因的表达，促进合成分泌缪勒管抑制因子，后者作用于副中肾管结构(即缪勒管结构，MuIleianduct),使其退化，因而阻止了46,XY胚胎中子宫、输卵管、阴道上1/3结构的发育5,12;而在睾丸间质细胞(Leydigcell,LC)中，NR5A1通过调控类固醇生成酶基因的表达，如类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenicacuteregulatoryprotein,StAR)x细胞色素P450类固醇羟化酶类，促进了以睾酮为主的雄激素分泌，从而诱导中肾管(Wolffianduct)分化成精囊、附睾和输精管,促进外生殖器男性化及睾丸的下降13。在胚胎期卵巢的发育过程中，FO
6、XL2(forkheadboxL2)通过直接与NR5A1近端启动子结合抑制其表达，抑制睾丸组织的发育。然而，在出生后成熟卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞中NR5Al表达却表现为增加。在颗粒细胞中,NR5A1通过与F0XL2相互作用，与其下游靶基因AMH启动子区域结合，上调其表达，而AMH对于促进卵泡发育和和维持卵巢储备功能至关重要2,14,15;在卵泡膜细胞中,NR5A1可上调StAR、芳香化酶(P450aromatase,CYP19A1).17-羟化酶/17,20-裂解酶Q7-hydroxylase/17,20-lyaseenzyme,CYPI7A1)基因的表达，促进类固醇激素的合成及卵泡的发育16
7、,17。NR5A1主要以单体形式结合DNA,通过识别靶基因启动子中含PyCAAGGTCA的DNA序列来调控睾丸、卵巢及肾上腺皮质类固醇激素相关基因的转录活性，包括StAK胆固醇侧链裂解酶(P450Cholesterolside-chaincleavage,CYP11A11).30-羟类固醇脱氢酶(3-hydroxysteroiddehydrogenase,HSD3B1)xII-羟化酶(Il-hydroxylase,CYP11B1),CYP17Alx21-羟化酶(21-hydroxylase,CYP21A2)x17B-羟类固醇脱氢酶3(17-hydroxysteroiddehydrogenase
8、s3,17-HSD3)xCYP19A1等4,18。2011年,SChimmer等19为了探究NR5A1基因对类固醇生成功能的影响，在Yl小鼠肾上腺皮质肿瘤细胞中，用ShRNA敲减NR5A1的表达,发现MC2R(melanocortin2receptor,ACTHR)的转录水平降低最为显著，而CYPllBLStARsHSD3B1、SCARBl的转录水平分别较野生型降低了30%90%以上，类固醇生成水平也大大降低，而当NR5A1表达恢复后以上靶基因的转录水平和类固醇生成量也出现了逆转。然而,CYP11A1的转录水平并未受到NR5A1敲除的影响，提示了不同靶基因的转录对NR5A1表达的依赖程度不同。
9、三、NR5Al敲除的动物模型研究在动物模型的研究中，Luo等通过靶向破坏编码小鼠SF-I的Ftz-Fl基因,发现Ftz-Fl基因纯合缺失的小鼠在出生后8天内死亡，并且出现肾上腺、性腺缺如，皮质酮分泌不足，而外源性补充肾上腺皮质激素可延长其生存时间，表明SF-I在肾上腺皮质的发育中起重要作用，其纯合突变会导致严重的肾上腺皮质功能不全。然而，杂合突变的小鼠往往仅有性腺发育不良但无肾上腺缺失，提示SF-I可能以剂量依赖的方式影响肾上腺和性腺的发育。有趣的是，Bland等20通过建立NR5A1敲除的杂合小鼠模型，发现虽然在静息状态下杂合子小鼠并无肾上腺功能不全的表现，但相较于野生型小鼠，杂合子小鼠的肾
10、上腺及性腺体积明显缩小，并且在应激诱导下皮质酮合成严重受损，无法维持正常代谢，这可能是由于NR5A1单倍剂量不足干扰了肾上腺发育，从而导致应激反应受损，提示NR5A1的正常基因剂量是获得足够应激反应所必需的。Karpova等21采用酵母人工染色体(yeastartificialchromo-some,YAC)Ko小鼠的基础上建立了转基因(SF-I-/；tg/+)小鼠，发现转基因雄性小鼠睾丸中出现精子发育停滞和隐睾等雄性化不足表现，胚胎期间质细胞发育延迟，而出生后小鼠的成年间质细胞发育被完全阻断，与其功能有关的转硫基酶(SUlfotranSferase,SULTlEl)和血管细胞黏附分子(vas
11、cularcelladhesionmolecule1,VCAMl)等基因表达显著降低，提示NR5A1的剂量与功能不足导致的间质细胞发育缺陷与雄性化不全表型相关。此外，Fatchiyah等22采用细菌人工染色体(bacterialartificialChromsomeslBAC)在KO小鼠的基础上采用双启动子和Tet-Off系统建立了转基因小鼠。发现这种转基因的“回补”在胚胎中成功恢复了脾脏的体积。然而,这种转基因的小鼠并没有获得存活的幼鼠，且CYP21A1和3-HSD标记基因在肾上腺原基中均无表达,说明肾上腺发育存在严重缺陷，提示不同的NR5A1的基因剂量，对于不同靶组织的发育，其影响水平有所
12、不同。四、NR5Al的突变功能域分布及剂量效应据报道,目前共发现了238例NR5A1突变，包括188种突变类型，其中90%患者的染色体核型为46zXY;这些突变广泛分布于各功能域，主要以DBD(35%)和LBD(42.3%)功能域为主。NR5A1突变类型多样，包括109种错义突变(58%),45种小片段缺失和插入(24%)导致的10个框内突变和35个移码突变，22种无义突变(12.3%),8个内含子变异(3.3%),4个终止密码突变(;该研究提示NR5A1的特定突变可以导致在46,XX胚胎中，未发育成熟卵巢向睾丸的方向转换，这可能是由于NR5A1抑制了-catenin介导的WNT信号转导,从而
13、使DAXl表达降低,减少了对睾丸通路的抑制。46,XXTDSD/OTDSD的患者临床表现也十分复杂，可表现为外生殖器偏向女性仅有阴唇融合或阴蒂肥大，有发育不全的子宫及陶道，也有表现为外生殖器男性化不足，如小阴茎、尿道下裂等，但此类患者多有睾丸组织发育不良，睾丸体积偏小,基础睾酮水平不足,甚至一侧或双侧性腺表现为卵睾，严重的可有睾丸功能衰竭，睾酮及AMH水平极低，hCG兴奋后睾酮水平仍较低，FSH、LH水平升高、生精障碍等46。由于这类患者表型差异大，性腺的发育可兼有卵巢和睾丸结构，其中是否存在寡基因突变的影响，或是否合并影响S0X9增强子的拷贝数变异，尚需要深入研究。6 .脾脏发育异常：NR5
14、A1不仅在肾上腺、性腺等组织中表达，也是脾脏发育过程中的关键调控因子。Zange等报道了一个新的NR5Alp.R103Q纯合突变，该患者表现为46,XY性反转和无脾症，但无肾上腺功能不全，推测可能是由于R1O3Q突变降低了TLXl的反式激活所致，TLXl是一种转录因子,已被证明对小鼠脾脏发育至关重要。此外，R1O3Q突变破坏了类固醇激素合成基因(CYPl7A1)的激活，而不影响NR5A和SRY对SOX9的协同激活。这例患者9个月时由于脾功能低下，出现了败血症。随后，另一研究小组又报道了1例出生表型为女性的46zXYGD患者,伴有多个脾脏,DNA测序发现此患者携带NR5Al基因LBD区杂合无义突变p.Tyr409*,遗传自患有尿道下裂伴有无脾症的父亲。然而,由于报道病例有限,NR5A1突变导致脾脏发育异常(无脾症或多脾)的机制有待进一步阐明47。六、小结NR5A1在人类肾上腺、性腺、下丘脑、垂体和脾脏中广泛表达，是胚胎期性腺及肾上腺发育过程中多种基因的重要调控因子，并且与类固醇激素合成相关基因表达密切，其突变会导致不同类型的DSD伴或不伴肾上腺功能不全，卵巢早衰、无精症以及脾脏发育异常等。目前的研究表明NR5A1下游靶基因众多，以剂量依赖的方式影响临床表型谱，但与其基因型之间关系仍有待进一步探索。
