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1、EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析,广州医科大学附属第一医院 病理科林毅妍,EGFR荧光原位杂交与免疫组化检测的比较分析广州医科大学附属,前言,近年来，以表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）为治疗靶标的分子靶向治疗在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）治疗中越显突出。EGFR基因的检测不仅可以为分子靶向药物的使用提供有效指导，也可以为肺癌治疗措施的制定以及肺癌预后的判定提供重要信息。目前临床病理工作中，对EGFR基因扩增的检测使用较多的方法有荧光免疫原位杂交（FISH）技术、免疫组化
2、（IHC）检测技术、PCR扩增检测技术等。本文将对荧光原位杂交与免疫组化两种检测进行比较分析。,前言 近年来，以表皮生长因子受体（epidermal,材料,标本来源：广州医科大学第一附属医院2010年1月2011年1月行支纤镜及手术切除的NSCLC病例，其中男性21例，女性19例；年龄3085岁，中位年龄58岁。所有标本均经10%中性缓冲福尔马林液固定，常规石蜡包埋。40例标本行连续切片，同时行FISH检测与免疫组化检测。,材料,主要试剂与仪器,蛋白酶 K，探针：GLP EGFR/CSP7探针（北京金菩嘉公司），胃蛋白酶消化液，人抗EGFR单克隆抗体（即用型）购于福州迈新生物公司。Dako 杂
3、交仪、观察用 Olympus BX51型显微镜和Nikon H600L荧光显微镜。,主要试剂与仪器,检测方法,（1）FISH检测：,3m组织切片TO脱蜡至水,煮沸去离子水处理15min,室温下2SSC中漂洗2次，每次5min,在组织上滴加蛋白酶K工作液，在37预热的孵育盒中消化35min,室温下用2SSC溶液中洗涤2次，每次5min，乙醇梯度脱水，自然干燥,避光环境中，探针混合液滴于玻片杂交区域,在温度80的自动杂交仪中变性5 min，42杂交16小时,第二天46水浴箱中2SSC10min，0.1%NP40溶液洗涤5min，室温70%乙醇3min,暗处自然干燥玻片后加DAPI复染液，放于暗盒中
4、复染5min,Olympus BX51型荧光显微镜在DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号,检测方法 （1）FISH检测： 3m组织切片TO脱蜡至水煮,检测方法,（2）IHC检测：,3m组织涂胶片，57烤片过夜，浸于二甲苯中脱蜡至水,在组织上滴加胃蛋白酶消化液，在37预热的孵育盒中消化30min,采用EnVision二步法，严格按照说明书操作,检测方法（2）IHC检测： 3m组织涂胶片，57烤片过夜,结果判断,（1）FISH结果判定：红色信号代表检测的靶基因，绿色信号代表靶基因所在的染色体着丝粒。检测EGFR基因计数100个细胞，统计Ratio值（100个细胞核中
5、红色信号数/100个细胞核中绿色信号数）。,FISH阳性分为：EGFR基因扩增：Ratio2为阳性结果；15个红色信号的细胞数占细胞总数的10%以上；出现成团红色信号的细胞；高多体性：Ratio2，但4个红色信号的细胞数占细胞总数的40%以上。,FISH阴性：Ratio2为无扩增。,结果判断 （1）FISH结果判定：红色信号代表检测的靶基因，,结果判断,（2）IHC结果判定：染色结果根据细胞膜着色的阳性细胞百分率和阳性染色程度评价。 着色细胞占计数细胞百分率5%为0分；625%阳性细胞为1分；2650%阳性细胞为2分；50%阳性细胞为3分。再结合染色强度，无色为0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕
6、褐色3分。将每张切片着色细胞百分率得分与着色程度得分相乘，为其最后得分。同一视野如有染色强度不一，取其平均值作最后得分。,01分为阴性（），23分为弱阳性（1+），46分为中等阳性（2+），6分以上为强阳性（3+）。,结果判断（2）IHC结果判定：染色结果根据细胞膜着色的阳性细,统计学处理,采用SPSS 17.0统计软件进行描述性分析。FISH技术与IHC法检测结果的比较使用x2检验。,统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件进行描述性分析。,结果 FISH,图1.EGFR FISH（+）（高多体）,图2.EGFR FISH（+）（点簇状 ）,图3.EGFR FISH（-）,结果 FISH图
7、1.EGFR FISH（+）图2.EGFR,结果 IHC,+,+,+,-,结果 IHC+-,结果,FISH技术与IHC法检测EGFR的结果比较见表1。,表1 FISH技术与IHC法检测EGFR的结果比较,40例NSCLC标本中，FISH显示为阳性的15例，其中IHC检测EGFR表达为（）的6例（40%），阳性的9例（60%）；FISH显示为阴性的25例，其中IHC检测EGFR表达为（）的19例（76%），阳性的6例（24%）。IHC检测阳性例数高于FISH检测阳性例数，差异无统计学意义（x2=5.184，P0.05）。,结果 FISH技术与IHC法检测EGFR的结果比较见表1。F,讨论,表皮生
8、长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，位于第7号染色体p1322区, 全长200kb, 由28个外显子组成，编码1186个氨基酸1 ,广泛分布于除成熟骨骼肌细胞、体壁内胚层和造血组织以外的所有组织细胞。EGFR 的异常高表达可见于多种恶性肿瘤，其活化可激活多种转录因子, 引起细胞的增殖、分化、迁移、黏附、抗凋亡和细胞转化等效应，在肿瘤进展、血管生成、转移扩散、凋亡受抑等方面起重要作用2。EGFR酪氨酸激酶抑制剂可抑制激活EGFR的酪氨酸激酶活性，从而阻断EGFR的功能，阻碍肿瘤的发生发展3。多数文献提示，分子靶向治疗晚期NSCLC疗效明显，而且治疗明显的患者中，EGFR基因突变的发生
9、率明显高于治疗无效的患者，EGFR基因检测可以作为患者应用分子靶向治疗的一个预测指标，在NSCLC个性化治疗过程中提供重要信息。,讨论 表皮生长因子受体(EGFR)是一种蛋白酪氨酸激,讨论,FISH技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中标本受影响较少，可以定量判读结果。 IHC法是临床常用的EGFR蛋白表达的方法。该方法操作简便，可重复性高，对仪器、材料的要求不高，是国内检测EGFR蛋白表达的主要方法。但IHC法在标本固定和处理中可能会使蛋白质变性破坏而影响检测结果，易造成假阴性或假阳性，且结果判断人为主观性较强。由于免疫组化方法因抗体类型与来源不同，以及所使用的评分系统的差异而导致结果差异
10、，不同抗体可使结果范围从12变至144。,讨论 FISH技术检测的敏感性和特异性较高，操作过程中,讨论,以FISH为标准，IHC与之比较：2例IHC法强阳性（3+）标本中，FISH检测EGFR基因扩增均为阳性，阳性预测值为100%；3例IHC中等阳性（2+）标本中，FISH检测EGFR基因扩增阳性为2例，阳性预测值为66.67% ；10例IHC弱阳性标本（1+），FISH检测EGFR基因扩增阳性为5例，阴性预测值为50%；25例IHC阴性（-）标本中，FISH检测EGFR基因扩增阴性为19例，阴性预测值为76%。总体而言，两种方法的符合率较低。但其中IHC法EGFR表达（3+）及（2+）的标本
11、，尤以强阳性（3+）标本与FISH检测EGFR基因阳性的一致性较高，与有关文献报到有所不同5，但该类标本例数较少，仅占总例数的12.5%，其一致性是否可靠需要进一步验证。,讨论以FISH为标准，IHC与之比较：,讨论,表2.2963 例乳腺癌HER-2 的IHC和FISH检测结果比较,以 FISH作为标准IHC 与之比较，其阳性预测值在IHC阳性(+以上)标本中为 91.6%，阴性预测值在 IHC 阴性(0或+)标本中为97.2%，在IHC弱阳性和阳性(0或+)标本中其敏感性为92.6%，在IHC阳性标本中其敏感性为98.8%6。,讨论表2.2963 例乳腺癌HER-2 的IHC和FISH检,
12、讨论,综上所述，免疫组化法对于评价患者是否使用EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗并非最佳的手段，但可作为筛选检查。,讨论 综上所述，免疫组化法对于评价患者是否使用EGFR,参考文献,1 Reiter J L, T hreadgill D W, Eley G D, et al. Comparat ivegenomic sequence analysis and isolation ofhuman and mousealt ernative EGFR transcripts encoding truncated recept or isofornlsJ . Genomics, 2001, 71(1):
13、1.2Jorissen RN,Walker F,Pouliont N,et al.Epidemal growth factor receptor：Mechanisms of activation and signalingJ.Exp Cell Res,2003，284（1）:31.3 Cunningham D, Humblet Y, S iena S, et al . Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer J . N En
14、gl J Med , 2004, 351( 14) :337- 345.4Buckley AF。Kakar scomparison of the Dako EGFR pharmI)xkit and Zymed EGFR antibody for assessment of EGFR status incolorectal adenocarcinomaJAppllmmunohistochem Mol Mor_phol，2007，15(3)：3053095周晓秋，王东关，孙希印，高摇虹，王琳琳，李新功. 非小细胞肺癌耘郧云砸基因和蛋白检测的比较分析J. 临床与实验病理学杂志，2012,28（10）：1124-1132.6刘艳辉.乳腺癌组织HER-2的荧光原位杂交和免疫组化联合检测的评价J.循证医学，2006，6(2)：81-83.,参考文献 1 Reiter J L, T hreadgi,谢谢！,谢谢！,
