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1、,脂质体及其在化妆品体系中的表征,时晓芳2016.6.8,脂质体及其在化妆品体系中的表征时晓芳,背景介绍,背景介绍,脂质体(liposomes)：将药物包封于类脂质双分子层内而形成的微型泡囊。也称类脂小球或液晶微囊。,脂质体的概念,脂质体(liposomes)：将药物包封于类脂质双分子层内,磷脂结构示意图,胆固醇的结构图,脂质体的组成,磷脂亲水的头部磷酸骨架水溶性分子（胆碱、丝氨酸、季胺盐等）疏,双分子结构：磷脂分子的亲水端呈弯曲的弧形，形似“手杖”，与胆固醇分子的亲水基团 相结合，形成“U”形结构。两个“U”形结构相对排列，则形成双分子结构,卵磷脂与胆固醇在脂质体中的排列形式,胆固醇与磷脂的
2、排列示意图,脂质体的结构,双分子结构：磷脂分子的亲水端呈弯曲的弧形，形似“手杖”，与胆,脂质体形成示意图,脂质体的形成,脂质体形成示意图脂质体的形成,Liposomes,Micelles,脂质体与胶束的区别,LiposomesMicelles脂质体与胶束的区别 脂质体,脂质体的分类,脂质体的分类,脂质体的分类-结构和粒径,多囊脂质体MVV 15m 缓释效应和储库效应,洋葱式,管状,球形、椭球形,多囊,Akbarzadeh et al. Nanoscale Research Letters. 2013,8:102,单室脂质体小单室SUV 20-100nm大单室LUV 100,脂质体材料,中性磷脂
3、,负电荷磷脂（酸性磷脂）,正电荷脂质,胆固醇（Ch),大豆甾醇及其葡萄糖苷,磷脂酰胆碱（PC）,磷脂酰乙醇胺（PE）,鞘磷脂（SM）,磷脂酸（PA）磷脂酰甘油（PG）磷脂酰肌醇 (PI)磷脂酰丝氨酸(PS),硬脂酰胺（SA）胆固醇衍生物,大豆甾醇葡萄糖苷(SG）大豆甾醇SS,脂质体的材料,不同材料，形成不同结构的脂质体,脂质体材料中性磷脂 负电荷磷脂正电荷脂质 胆固醇（Ch)大,磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline,PC),脂质体的材料-中性磷脂,(a)全饱和磷脂 （紧密排列）,(b)非饱和磷脂（不能紧密列）,磷脂脂肪链的饱和度对磷脂膜排列的影响,天然的PC a. 从蛋黄、大豆
4、、牛心脏和脊髓提取b. 每一种PC具有不同长度、不同饱和度的脂肪链 植物性PC的脂肪链具有高度不饱和性 动物性PC的脂肪链大部分是饱和的合成的PC 二棕榈酰胆碱（DPPC)、 二硬脂酰胆碱(DSPC) 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC),磷脂酰胆碱(phosphatidyl choline,PC,特性：头部基团小； 非饱和的PE容易形成非双层结构型 -六角相（制备特殊脂质体）,六角相,磷脂酰乙醇胺（PE）,脂质体的材料-中性磷脂, 磷脂酰乙醇胺(phosphatid ethanolamine, PE),特性：头部基团小；六角相 磷脂酰乙醇胺（PE）脂质体,特性：酰胺键和羟基基团之间形成氢键相互作
5、用，因此，比PC具有更高秩序的胶相。,SM,脂质体的材料-中性磷脂, 鞘磷脂（sphingomyelin,SM）,特性：酰胺键和羟基基团之间形成氢键相互作用，因此，比PC具有,磷脂酸(phosphatidic acid,PA),磷脂酰肌醇(phosphatidyl inositol,PI),磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine, PS),负电荷磷脂（酸性磷脂）,脂质体的材料-负电荷磷脂,电荷增加脂质体透皮吸收,磷脂酸 磷脂酰肌醇 磷,磷脂酰胺(Stear amide, SA),胆固醇衍生物CDBA和CTBBA,脂质体的材料-正电荷脂质,Liu XM, Yang B, etc.
6、Biochim Biophys Acta, 2005, 1720(1-2), 28-34.Liu XM, Yang B, etc. Chem Mater, 2005, 17(11), 2792-2795.,磷脂酰胺 胆固醇衍生物CDBA和CTBBA,包裹物质,脂溶性药物 定位于双分子层脂质膜间,两性化合物 定位于水相与膜内部交界磷脂上,水溶性药物 包裹在水相,不能包裹物质,在水相和有机溶剂中都不溶的物质,在两种介质中溶解性都非常好的物质,脂质体的包裹作用机理,单室脂质体,多室脂质体,包裹物质脂溶性药物 定位于双分子层脂质膜间两性化合物 定,脂质体与细胞的相互作用：吸附、脂交换、内吞、融合,脂质
7、体与细胞的相互作用,脂质体与细胞的相互作用：吸附、脂交换、内吞、融合脂质体与细胞,在护肤品领域，一般是指用卵磷脂类形成双分子层微囊，把需要被皮肤吸收利用的原料包裹在其中；将对皮肤有养护作用的原料，用卵磷脂包裹后，有这样几个好处：,提高吸收效率 脂质体细胞膜的磷脂双分子层的结构非常接近，提高脂质体的经皮吸收效率。对被包裹物质提供保护 脂质体可以将油性原料分散在亲油层中，也可以将水性原料包裹在脂质体球心。而磷脂则可以将有效成分与空气隔离开，使有效成分更长久的保存，延长产品的保质期，也可以延长涂抹在皮肤上后的有效时间。降低配方难度 由于卵磷脂独特的亲油亲水性，脂质体可以随意分散在水中，不增加乳化工作
8、。,脂质体作为化妆品载体的应用原理,在护肤品领域，一般是指用卵磷脂类形成双分子层微囊，把需要被皮,亮剑之旅拓展训练课程,化妆品领域衍生的脂质体类型,脂质体变换形式,化妆品：脂质体的透皮吸收和缓释作用是重点，修复性，保护性，增效性,膏霜类化妆品一般加多室或多囊脂质体,亮剑之旅磷脂药物磷脂凝胶脂质体化妆品领域衍生的脂质体类型脂质,脂质体的理化性质,脂质体的理化性质,相变温度(phase transition temperature, Tc),脂质体,升高温度,至一定温度,膜的物理性质改变膜的横切面增加、双分子层厚度减少、膜流动性增加,脂质双分子层中酰基侧链排列改变 有序排列变为无序排列,相变温度T
9、c,脂质体的理化性质相变温度Tc,相变温度(phase transition temperat,Tc以下时，为“胶晶态”（脂肪链全反式，排列紧密，刚性和厚度增加）Tc以上时，为 “液晶态” （脂肪链伸缩、弯曲、外扭）磷脂发生相变时， “胶晶态” “液晶态” “液态”共存，出现相分离，使膜的流动性增加，易导致内容物泄漏。,相变温度与脂质体膜稳定性,脂质体的理化性质相变温度Tc,Tc以下时，为“胶晶态”（脂肪链全反式，排列紧密，刚性和厚度,脂质体应用的局限性稳定性,脂质体应用的局限性稳定性形貌粒度Zeta电位包封率磷脂含量,脂质体表征,电镜法,脂质体表征电镜法,常规电镜法,Fig 1 脂质体的TE
10、M,Fig 1 脂质体的TEM,Fig 3 脂质体的AFM,Fig 2 脂质体的SEM,常规电镜法缺点：1. 样品干燥后失去原貌 2. 分辨率不高，不能区分脂质体和其他纳米颗粒。,Aline F Xavier, Daiana K Deda2, et al. IJABPT, 2016, 7(2), 303-313,Ruan L P, Zhang H Y, Luo H L, et al. Science in China Series B: Chemistry, 2009,常规电镜法Fig 1 脂质体的TEM测试项目样品制备缺点局限,方案一：冷冻制样及扫描电镜传输系统 (Cryo-SEM),低温扫
11、描电镜样品制备及观测过程,样品独立制备与分析：镀膜仪真空镀膜后保持真空状态转移到SEM，在制备与分析之间无污染样品转移。,保留样品原貌,分辨率较高,优势,缺点：只能观测表面结构,Cryo-TEM,方案一：冷冻制样及扫描电镜传输系统 (Cryo-SEM)低温,方案二：冷冻制样及透射电镜传输系统 (Cryo-TEM),低温透射电镜样品制备及观测过程,高压冷冻仪可与超薄切片机及冷冻样品杆配合，进行低温透射电镜观测,测试方法：将蘸在铜网上的样品溶液或分散液的液膜 急速冷冻，即在铜网上形成玻璃态水膜， 无冰晶产生。在样品传输、进样、TEM观察的过程中始终 保持低温。 对于囊泡类样品的观察，通常使用这种方
12、法。,方案二：冷冻制样及透射电镜传输系统 (Cryo-TEM)低温,保留样品原貌,分辨率较高,优势,可观测不同类型的脂质体内部结构,+,方案二：冷冻制样及透射电镜传输系统 (Cryo-TEM),外部资源：中国科学院上海生命科学研究院中国科学院上海巴斯德研究所同济大学,Sugikawa K et al. Angewandte Chemie International Edition, 2016.Jonas Gustafsson et al.Biochimica et Biophysica Acta 1995,保留样品原貌分辨率较高优势可观测不同类型的+方案二：冷冻制样,方案三：类细胞切片制样+常
13、规电镜技术SEM&TEM,类冷冻切片制样法：类似冷冻切片与细胞切片制备的方法，对化妆品样品进行固定包埋（石蜡包埋），然后进行切片，然后将其放在铜网或硅片上进行制样，对脂质体成像。,分辨率能达到纳米级别,细胞切片法常常用来区分亚细胞结构,样品制备简单，成本低，资源广,脂质体的形貌大小的表征,独创的方法,ACS applied materials & interfaces, 2015, 7(14): 7526-7533.,方案三：类细胞切片制样+常规电镜技术SEM&TEM类冷冻切片,Yigong Shi al. Structure of a yeast spliceosome at 3.6-ang
14、strom resolutionJ. Science, 2015, 349(6253): 1182-1191.,方案四：高分辨冷冻透射电镜(HR-Cryo-TEM),2013年，冷冻电镜技术在照相技术和软件分析的图像处理技术方面取得突破性进展成为施一公实验室诺奖级工作-剪切体的结构解析的关键性工具,HR-Cryo-TEM,诺贝尔奖热门,2014 年全球科技十大进展,结构生物学的突破性工具,最高分辨率达2.2 ,优势,Yigong Shi al. Structure of a,区分不同结构和类型的蛋白质,分辨率达到原子水平,SCIENCE3481147-1151(2015)FEBS Journa
15、l 280 (2013) 2845,区分不同结构和类型的脂质体,方案四：超高分辨冷冻透射电镜(HR-Cryo-TEM),局限性：外部资源少,国家蛋白质科学中心-上海,区分不同结构和类型的蛋白质分辨率达到原子水平SCIENCE,脂质体表征,荧光法,脂质体表征荧光法,方案五：胆固醇荧光标记+荧光共聚焦显微镜,胆固醇与脂质体异性结合，对胆固醇进行荧光修饰，通过confocal 观测荧光脂质体结构,缺点：分辨率较低，可能无法达到几十纳米级别,超高分辨率荧光显微镜,优点：专属性，排除其他物质干扰，外部资源多,Sung T C et al. Scientific reports, 2016, 6.,Shi
16、 X et al. Polymer Chemistry, 2013,方案五：胆固醇荧光标记+荧光共聚焦显微镜胆固醇与脂质体异性结,方案五：胆固醇荧光标记+荧光共聚焦显微镜,方案五：胆固醇荧光标记+荧光共聚焦显微镜,超高分辨率荧光显微镜 （分辨率达到分子级别1nm 左右，2014年诺贝尔化学奖）,STORM 技术的开创者庄小威,2014诺贝尔化学奖,方案六：胆固醇荧光标记+超高分辨荧光显微技术,Stefan W. Hell,W. E. Moerner,Eric Betzig,超高分辨率荧光显微镜 （分辨率达到分子级别1nm 左右，20,X. Zhuang，Science 317 1749-175
17、3 (2007) Nature Methods 3793-795 (2006) Science319 810-813 (2008),低分辨荧光显微镜和超高分辨荧光显微镜图片的对比,局限性：外部资源少,方案六：胆固醇荧光标记+超高分辨荧光显微技术,优点：突破光学极限的分辨率： 1nm 左右， 具有专属性，可作为通用的方法,北大工学院席鹏课题组上海交大李小卫课题组,X. Zhuang，Science 317 1749-175,Seeing is Believing,分辨率非常重要,大小,形貌,结构,Conclusion:,Seeing is Believing 分辨率非常重要大小形,化妆品终体系中
18、脂质体的表征方案,一、假设脂质体加入化妆品体系之后仍然稳定存在，则使用Cryo-TEM或者切片法检测，这两种方法保留了脂质体的原貌，理论上可以分辨出脂质体的双层结构。受配方体系中其他添加剂的影响不大，而且对体系纯度要求不高。二、对于一些特例。比如低倍的Cyro-TEM或者切片法观测不到脂质体,不确定是否稳定存在于体系中，可以尝试使用荧光法。该方法对样品纯度没有要求。如果在共聚焦显微镜不能看到完整的脂质体形状，说明脂质体极大可能已经被破坏，那么这样的脂质体在体系中发挥不了增溶的作用，已经没有太大的实用价值。三、如果在共聚焦显微镜下可以看到完整的脂质体形状，可以进一步尝试高分辨Cryo-TEM 或
19、者超高分辨荧光显微镜进行观察。对于复杂样品体系，需要多种表征方法一起反复确认，以保证观测结果的可靠性。,化妆品终体系中脂质体的表征方案一、假设脂质体加入化妆品体系之,激光粒度仪DLS,脂质体表征,激光粒度仪DLS脂质体表征,激光粒度扫描仪-水合粒径,原理：在不同的角度上测量散射光的强度，得到样品粒度分布,体积分布与数量分布之间的转换关系,颗粒平均粒径表示方法 体积（D4,3） 表面积（D3,2） 数量不同颗粒均值对颗粒分布的 不同特征敏感,激光粒度扫描仪-水合粒径原理：在不同的角度上测量散射光的强,脂质体的水合粒径表征，应根据具体的样品体系选择合适的表示方法,激光粒度扫描仪-水合粒径,脂质体的水合粒径表征，应根据具体的样品体系选择合适的表示方法,包封率,脂质体表征,包封率脂质体表征,脂质体的包封率测定,脂质体的包封率测定 方法原理特点与适用范围缺点HPLC法参,样品处理方法：用透析法，超速离心法或凝胶柱层析法分离游离A。2. 对脂质体进行破乳后测包裹的A含量。,反相液相色谱法测定包封率,包封率（%）= W包/W总 100%,包封率（%）= （1-W漏）/ W总100%,样品处理方法：反相液相色谱法测定包封率包封率（%）= W包/,Thanks！,Thanks！,知识回顾Knowledge Review,知识回顾Knowledge Review,
