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1、PCR引物设计及相关软件使用,PCR引物设计及相关软件使用,主要内容,PCR介绍引物设计原理引物设计的优化原则Primer Premier 5.0 介绍举例说明引物的设计,主要内容PCR介绍,PCR介绍,1、什么是PCR2、PCR的组成3、如何提高PCR成功率 （定量，对照）,PCR介绍1、什么是PCR,引物设计原理,引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选 。,引物设计原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片,PCR引物设计及PrimerPremier50使用介绍课件,引物设计的原则,
2、1、引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(1618)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引 物。有人用2023个核苷酸引物得到40 kb的产物。,引物设计的原则1、引物长度,引物设计的原则,2、引物GC含量 GC含量在40%60%之间，以45-55为宜。这可为有效退火提供足够热。,引物设计的原则2、引物GC含量,引物设计的原则,3、引物Tm 引物所对应模板序列的Tm 值最好72左右。至少要在5580之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G),引物设计的原则3、引物Tm,引物设计的原则,4、引物3端引物3末端和模板的碱基完全配
3、对 防止一对引物内的同源性 考虑末端5个碱基的G 引物3端要避开密码子的第3位,引物设计的原则4、引物3端,引物设计的原则,5、引物序列与模板序列组成的相似性 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高 。,引物设计的原则5、引物序列与模板序列组成的相似性,引物设计的原则,6、最好在模板cDNA的保守区内设计 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。,引物设计的原则6、最好在模板cDNA的保守区内设计,引物设
4、计的原则,7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。,引物设计的原则7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列,引物设计的原则,8、碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。,引物设计的原则8、碱基要随机分布,引物设计的原则,9、引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。,引物设计的原则9、引物应具有特异性
5、,引物设计的原则,10、G值 G值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的G值最好呈正弦曲线形状，即5端和中间G值较高，而3端G值相对较低，且不要超过9（G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。,引物设计的原则10、G值,引物设计的原则,11、引物的5端 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰，引物5 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。,引物设计的原则11、引物的5端,引物设计的原则,12、在DNA测序和PCR中最好用5末端稳定(如GC含量较多)，而3
6、末端不太稳定(如AT含量较多)的引物,引物设计的原则,Primer Premier 5.0 简介,主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA 基元(motif)查找4、同源性分析,Primer Premier 5.0 简介主要功能:,Primer Premier 5.0使用介绍,Preimer Premier 启动界面,Load sequence,Primer Premier 5.0使用介绍Preimer,基本信息,Sequence name,Original sequence,Use these two button to translate the DNA seq to a
7、 protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好,Choose a function,基本信息Sequence nameOriginal sequ,引物设计界面,First you can design the primer manually,Sense strand or anti-sense strand,Useful information of the primer,引物设计界面First you can design the,引物搜索选项设定,引物类型,搜索模式,5引物位置范围,3引物位置范围,产物大小范围,引物长度,引物搜索选项设
8、定引物类型搜索模式5引物位置范围3引物位置,搜索结果,28对引物,引物分值100分为满分,每对引物的信息,双击选中一对引物,搜索结果28对引物引物分值每对引物的信息双击选中一对引物,引物信息,回到主窗口,引物及产物信息,是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer,引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,di,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But ,一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最,引物编辑,引物编辑,引物编辑,Edit primer here,Analy
9、sis the edit result,Accept the edit result Return to the main window,引物编辑Edit primer hereAnalysis t,任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1,举例说明,任务举例说明,SP,BamHI,pcDNA3.1,NR1,Plasmid 1:,Plasmid 2,GFP,SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid 1:P,SP,BamHI(GGATCC),pcDNA3.1,NR1-1a,GFP,SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aG,121 ggggctccta gagaac
10、ccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg aca
11、cggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc g
12、cacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa,NR1的编码序列(4000bp),红色为信号肽, 蓝色为BamHI酶切位点, 下划线标出酶切位点的阅读框,NR1的编码序列(4000bp)红色为信号肽, 蓝色为
13、Ba,ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCG
14、A AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA C
15、CACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAA,GFP序列(700bp),GFP序列(700bp),引物要求,PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变,引物要求PCR扩增GFP,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGT
16、ACAAGTAA 3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGAGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5,GFP序列,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3,3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5,Primer1: 5ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC,.AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer2,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2: 5 TTA
17、CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC.,Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,第一步：扩增GFP基本序列,变性, 引物复性,GFP序列3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG,第二步：GC比值；Tm值,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA.Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA.,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTAC
18、AGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）,第二步：GC比值；Tm值Primer1: 5 ATG,第三步：酶切位点,Primer1: 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA （GC:60%,Tm：64）Primer2: 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC （GC:57%,Tm：66）,BamHI: ggatcc,Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,第三步：酶切位点Primer1: 5 ATGGTGA,第四步：阅读框,atgagcaccatgca
19、cctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct.,Primer1: 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA,NR1序列：,Pr
20、imer1: 5 ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA,第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgac,atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc cgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat
21、 acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct,NR1序列：,5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3,GFP序列,cgc gcg gat ccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agct
22、caacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct,插入GFP后的组合序列,atgagcaccatgcacctgctgacattcgcc,Primer2: 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,Primer2: 5 gg atc cct CTTGTACAGCTCGTCCATGCC,Primer2: 5 ggatccCTTGTACAG,第五步 保护序列,Primer1: 5 GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2: 5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC,第五步 保护序列Primer1: 5 GCGGgg,PCR引物设计及PrimerPremier50使用介绍课件,
