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1、蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析,蛋白质免疫印迹技术及,Western Blot简介Western Blot一般流程Western Blot常见问题分析,Western Blot简介,Western Blot 简介：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析
2、称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。,Western Blot 简介：印迹法（blotting）是,Western Blot 基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。,转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合
3、物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。,Western Blot 基本原理：转移后的NC膜就称为一个,Western Blotting方法,直接法：优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便,Western Blotting方法直接法：,间接法：优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点） 3.多种标记的二抗可供选择 4.可选择不同的Marker缺点： 1.有交叉反应引起的非特异性条带
4、2.额外的二抗孵育以及条件优化,间接法：,处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。,目前有结合各种标记物的抗特定IgG的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。,处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，,直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记
5、二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。所以一般情况下都釆用间接法进行检测。,直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不,Western Blot 优点：结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种优点,高分辨率的电泳技术 特异敏感的抗原-抗体反应 1-5ng （最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白,Western Blot 优点：结合了凝胶电泳的高分辨率和固,Western Blot应用,目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析,Wester
6、n Blot 被广泛地应用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。,Western Blot应用目的蛋白的表达特性分析Weste,Western Blot 流程,蛋白样品的制备SDS-PAGE转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,Western Blot 流程蛋白样品的制备,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白,蛋白样品的提取,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白
7、蛋白样品的提取,蛋白样品的定量,目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总：http:/,蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradfo,1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺 SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成分,1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯,1.1 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝
8、胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N-亚甲基双丙烯酰胺(N,N-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。,1.1 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(p,聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：,单体：丙烯酰胺（Acr）；交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；产物：三维网状结构凝胶,聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过
9、提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（APTEMED）和光化学催化（核黄素TMTED）体系。,影响聚丙烯酰胺凝胶聚合的因素：试剂的纯度；温度；氧气；AP、TEMED原则：尽量少的催化剂并在最佳时间内聚合。,聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：单体：丙烯酰胺（Acr）；聚丙烯酰,1.2 蛋白样品的变性,2SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95100加热515min，冰上冷却后再上样，使蛋白充分变性，保证
10、蛋白质从空间结构变为一级结构。电泳样品已准备就绪，可立即使用也可以分装冻存，-20存放的样品可稳定保持数月。,100mM Tris-HCl(pH6.8)200mM DTT4%SDS0.2%溴酚兰20%甘油ddH2O,1.2 蛋白样品的变性2SDS-PAGE上样缓冲液：1M,SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷
11、的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。,【SDS-PAGE基本原理】,SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的,SDS：,阴离子去污剂 变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。,SDS：阴离子去污剂 变性剂,蛋白
12、质-SDS胶束的特点：,（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g 蛋白质结合1.4g SDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比,蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长,不连续的电泳缓冲体系。SDS蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,不连续的电泳缓冲体系。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,1.3 不连续电泳：,电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。,1.3 不连续电泳： 作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋,1.4 凝胶浓度与
13、蛋白分离范围,SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方表：http:/,1.4 凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（K,1.5 SDS-PAGE凝胶配制 配制相应浓度的SDS-PAGE分离胶，TEMED加入后迅速混匀制胶，沿壁迅速灌注分离胶溶液，留出积层胶所需空间（梳齿长再加1cm）。覆盖5mm水(或异丙醇）层于分离胶溶液上，约30-60min后分离胶和水层之间会出现清晰界面，表明分离胶充分聚合（可微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合）。 ddH2O轻轻洗涤凝胶顶部数次，以除去未聚合的凝胶，再用滤纸吸净残留液体，注意不要接触胶面。,灌制分离胶,1.5 SDS-PA
14、GE凝胶配制 灌制分离胶,SDS-PAGE凝胶配制 覆盖层可保持胶面平整和防止空气进入，因为氧气扩散进入凝胶会抑制聚合反应。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。胶浓度10%时可用0.1%的SDS封，浓度10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。,ddH2O0.1%SDS:8%,隔绝空气,SDS-PAGE凝胶配制 ddH2O隔绝空气,灌制积层胶 插入梳子,凝胶的质量直接影响以后的实验结果，要特别注意几点：凝胶要均一没有气泡；积层胶与分离胶界面要水平；AP和TEM
15、ED的量不能过多，太多会导致胶易脆裂；拔梳子时要快，尽量保证点样孔平整。,灌制积层胶 插入梳子,注意事项：1.抗原样品与缓冲液混合水浴加热时不要进水！最好采用空气浴；2.电泳Buffer最好不要重复利用，因为样品比较珍贵，而电泳液相对廉价；3.Buffer一定要漫过梳子孔，否则就会发现蛋白跑不动；4.电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，不要追求速度，慢慢跑条带会分离的更好，特别是对于高分子量的目的蛋白。,Staking gelSeparating gel注意事项：,2.转膜,要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用
16、的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。,2.转膜要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如N,转移膜的选择,最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。各种膜的详细特点介绍：http:/,转移膜的选择最常用于Western Blot的转移膜主要是硝,转印膜比较,转印膜比较,膜的选择主要根据：a.膜与目的蛋白
17、分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。,膜的选择主要根据：,湿转系统,湿转系统,半干转移系统,半干转移系统,丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。印度墨汁不能和化学发光物合用，若是使用呈色反应的酶检测法时，印度墨汁的黑色会使凝胶难于拍照。,转膜后检测（此步可以省略
18、）,丽春红染色转膜后检测（此步可以省略）,封闭,为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司）Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。,一般封闭条件为：室温或者 37缓慢摇荡12h，特殊情况也可 4过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。 封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST
19、或者PBST。,封闭为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，,一抗、二抗孵育,把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜。 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。,一抗、二抗孵育把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光显色法(HRP),二抗
20、与底物反应显色辣根过氧化物酶法（HRP）,碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP)转化为蓝色的产物；辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑TMB氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺(luminol，氨基苯二酰一肼)并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。,碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(BCIP, HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂
21、各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存AKP标记二抗用AP显色，在10mlAKP缓冲液中加入66l BCIP溶液混匀，室温下将膜放入显色（37可加速反应）5-15min。对照Marker记录实验结果，将NC膜晾干扫描保存。底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时间）, HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取,膜解吸方法
22、（膜的重复利用）,通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。,蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。,膜解吸方法（膜的重复利用） 通过加热和去污剂进行解吸 蛋白样,Western Blot结果分析,目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测
23、内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。,Western Blot结果分析目的蛋白的灰度值除以内参的灰,常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般要选择一个在处理因素作用的条件下蛋白含量不会发生改变的蛋白作内参。 为了让实验更加严谨有说服力都要设计对照实验，对照分为：阳性对照（最好有标准品（比如-actin，GAPDH）或阳性
24、血清）；阴性对照（测血时用相应小鼠未免疫血清（即正常血）；空白对照（不加一抗，用PBS代替）；无关对照（用无关抗体）。,常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-acti,成功进行 Western Blot 检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到 Western Blot 的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性；内参对照：检测标本的质量和二抗系统；
25、空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果,成功进行 Western Blot 检测，设置合适正确的对照,Western Blot常见问题分析,Western Blot常见问题分析,SDS-PAGE电泳,胶不平？凝胶漏液？,胶板洗刷干净加入AP和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐,SDS-PAGE电泳胶不平？胶板洗刷干净,条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？,凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致
26、宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适,SDS-PAGE电泳,条带比正常的窄？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻,转膜及抗体检测,凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？,可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温,转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲,转移到膜上的蛋白很少,转移到膜上的蛋白很少蛋白分子量 10KD 原因对蛋白分子量,背景太高,膜没有均匀浸湿 原因对转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿背景太,杂交信号很弱,杂交信号很弱抗体保存不当 原因对抗体长期保存应在70，使,出现非特异带,一抗不是唯一特异的 原因对制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原,Further Readings,生物秀Western Blotting专题http:/ Millipore的蛋白印迹手册http:/ Bio-Rad的western Blotting操作手册http:/ Western blot问题解答专帖http:/,Further Readings生物秀Western Blo,谢谢大家！,谢谢大家！,
