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1、概述,生物化学检验是以健康和疾病时的生物化学过程为研究目的，通过测定组织、体液的成分，揭示疾病变化和药物治疗对机体生物化学过程和组织、体液成分的影响，以提供疾病诊断、病情监测、药物疗效、预后判断和疾病预防等有用信息的一门学科。,常用的生物化学检验技术,在临床生检验和临床生化科研中常应用多种分析技术、包括光谱分析技术、电化学分析技术、电泳分析技术、层析和离心分析技术及自动化分析技术等，其中光谱分析技术是最基本和最常用的，它具有灵敏、准确、快速、简便、选择性好和不破坏等特点而被广泛应用，生化分析仪采用的就是光谱技术中的吸收光谱法和比浊法。,吸收光谱法,吸光度的定义一束强度为Io 的平行单色光通过一
2、个含有浓度为C 的吸光物质、厚度为L 的吸收池时，如下图，一些光被吸收，光强从Io 衰减为It，则该溶液的吸光度（A） 等于：A=-lg It /Io 其中It / Io 称为透光度（T），所以A=-lg T=lg Io / It,吸收曲线,波长从200nm-400nm 的电磁波，称为紫外光，波长从400nm-760nm 的电磁波，称为可见光。以波长()为横坐标，以吸光度为纵坐标而绘制出的一条曲线称为吸收曲线，在一段波长范围内，有最大吸收波长max 和最小吸收波长min，在最大吸收波长处测定可获得最大的测定灵敏度。,Lamber-Beer 定律（A = CL）,Lamber-Beer(朗伯比耳
3、 ) 定律的意义为：某溶液的吸光度等于该物质的吸光系数 、浓度C 和光径L(cm)的乘积，当光径不变时，浓度和吸光度成正比，这是生化分析仪利用吸收光谱法进行定量测定的基础，见下图：前提条件：(1)被吸收光为单色平行光，(2)待测定溶液为稀溶液,吸收光谱法在生化分析仪上的应用,除特种蛋白外的大部分临床生化项目，配以相应的试剂，均可利用吸收光谱法在生化分析仪上进行测定。如酶类：包括ALT，AST，ALP，ACP，r-GT，-HBDH，LDH，CK，CK-MB,-AMY等。底物/代谢产物类：包括TG，TC，HDL-C，LDL-C，UA，UREA，Cr，Glu，TP，Alb，T-Bil，D-Bil，N
4、H4+,CO2 等。无机离子类：包括Ca，P，Mg，Cl 等。,比浊法,分类比浊法分两类：透射比浊法和散射比浊法。 带有小粒的悬浮液和胶体溶液都具有向四面八方散射入射光的性质，当一束平行光通过含有悬浮质点的悬浮液或胶体溶液时，同时受到散射和吸收两个因素的影响，使光的强度减弱。在光源的光路方向上测量透射光(实际上还包括散射光)强度与入射光强度的比值，并通过该比值测定出悬浮液或胶体溶液中质点的溶度，称为透射比浊法，在光路的其他方向上测定测量散射光强度，从而测定出悬浮液或胶体溶液中质点的溶度，称为散射比浊法。,1) 透射比浊法,原理： 一束强度为 的平行单色光通过一个含有悬浮质点(颗粒大小与光源波长
5、接近)的悬浮液或胶体溶液时，如下图，其透射光强度I 可用下式表示： I = IoeL L 为悬浮液或胶体溶液在光前进方向上的长度， 为浊度系数，与悬浮质点的浓度C成线性关系。令=2.3KC，则： lgIo/ I=KCL 该式与Lamber-Beer 定律相似，这是生化分析仪利用透射比浊法进行定量测定的基础。,2) 散射比浊法,原理：一束强度为Io 的平行单色光通过一个含有悬浮质点(颗粒大小远小于光源波长)的悬浮液或胶体溶液时，如下图，与入射光垂直方向上，其散射光强度I 可用下式表示：式中，n1、n2 分别表示质点与介质的折射率，表示单位体积内的质点数，r 表示质点半径。可见散射光强度与悬浮质点
6、的浓度成正比，这是利用散射比浊法进行定量测定的基础。,比浊法在生化分析仪上的应用,透射比浊法 可以与吸收光谱法共用一个检测器，所有生化分析仪，不需增加任何部件，均可利用此法进行测定。大部分特种蛋白，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、C4 等)、免疫球蛋白类(IgA，IgG ，IgM 等)等，配以相应的试剂，可利用此法在生化分析仪上进行测定。散射比浊法 因另需在光路垂直方向上增加一检测器，目前只有极少数生化分析仪可利用散射比浊法进行定量测定，而几乎所有的特种蛋白分析仪、免疫分析仪等都能利用散射比浊法进行定量测定。,自动生化分析方法的分类,概述自动分析方法首先是基于常规实验室的
7、基本方法，如终点法和连续监测法。由于自动生化仪使用了高新技术，使这些方法得到了扩展。终点法包括单波长和双波长终点法、比色法和比浊法，一点终点法和两点终点法。连续监测法可分为速率A、速率B、两点速率，也可选择双波长。校正方法有多点线性校正、非线的对数校正和量程法。,一、终点法,定义：终点法是实验室常用的方法之一。它是反应混合物经过一定时间反应后，达到平衡（终点），即在呈色反应稳定阶段时，检测其颜色对光的吸收强度，以此计算待测物的浓度。终点法可分为一点终点法和两点终点法。,一点终点法,一点终点是使用一种或两种试剂，当样品和试剂混合后，待测物与试剂的物理化学反应达到终点时，测定一次吸光度，计算待测物
8、的浓度。该法具有代表性的试验有：总蛋白、清蛋白、葡萄糖氧化酶等。如图所示：t1 时刻加入试剂（体积为V）， t2 时刻加入样本（体积为S），然后搅拌并反应，之后测量反应液的吸光度，在t3 时刻反应达到终点； t3-t2 为测定时间。,两点终点法,两点终点法也称因定时间法，它可以用一种试剂或两种试剂。这种方法是近年来，可加双试剂的生化分析仪问世后，才被广泛应用。优点是可以消除样品、试剂的颜色、浊度，以及一些干扰物对测定的干扰。原理是：加入样品试剂1 读取A1 试剂2 读取A2，其中要读取两次吸光度值，第一次相当于读出样品空白的值，加入试剂2至第二次读数才是实际呈色反应，因此A=A1-A2。比浊法
9、也是一种终点法，不过是一种浊度测定，而不是比色测定。比浊法可分为化学比浊法与免疫比浊法，免疫比浊法又分为透射比浊法和散射比浊法。免疫比浊法目前主要用于血清特种蛋白的测定，如载脂蛋白(apoAI,apoB 等)、补体类(C3、C4 等)、免疫球蛋白类(IgA，IgG ，IgM 等)以及药物监测等。,双试剂单波长,t1 时刻加入第一试剂(体积为V1)，t2 时刻加入样本(体积为S)，之后搅拌，t3 时刻加入第二试剂(体积为V2)并立即搅拌，t4 时刻反应达到终点。t3-t2 为孵育时间,t4-t3 为测定时间。,二、连续监测法,连续监测法属于动态法检测的一种，适用于酶活性测定和代谢物检测，多有酶的
10、参与。该法是通过适当的仪器，连续测定酶促反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的情况。原理是：在酶反应的最适条件下，用物理、化学或酶促反应的分析方法，在反应速度恒定期（零级反应期）来连续观察和记录一定时间内底物或产物量的变化，以单位时间酶反应初速度计算出酶活力大小代谢物的浓度。计算方法有：1）绝对法：酶活力（U/L）=A（反应液体积/样品体积）（1000/消光系数）；2）相对法：酶活力（U/L）= A （测定）/ A （标准） 标准物的活力或浓度。,三、双波长法,双波长法不仅适用于终点法，也可用于动态监测法（连续监测法）。其原理是：检测器在对待测物进行检测时，同时用两个波长进行检测，用主
11、波长的吸光度减去副波长的吸光度，标准物（校准品或标准品等）与待测物同等对待，计算待测物的浓度。优点是可以消除背景吸收，而减少样品的颜色和浊度所产生的影响，它不仅可以有效地校准样品的混浊、溶血、黄疸等，还可以对电源波动有补偿效果。这种方法是较新型全自动生化分析仪的特点之一。,生化试剂,从二十世纪四五十年代开始产生第一代生化试剂开始，生化试剂得到了迅速的发展，从手工配置到大工业化生产，从单一的几个项目发展到现在七十多个项目，以及各种封装形式的出现，生化试剂在测试项目，测试反应的特异性、试剂的稳定性、测试结果的重复性和准确性、测试的线性范围等方面都发生的质的变化，而且这种发展现在仍然在迅猛的进行中。
12、,临床生化试剂的发展历史,第一阶段：各医院实验室通常自行配制简单试剂，能开展的生化检测的方法及检测项目十分有限，无统一标准，准确性极差。第二阶段：使用时要用多种试剂配制在一起，稳定性很差，多数在冰箱内只能保存数天，并且操作繁琐费时，容易加错试剂。第三阶段：冻干试剂、干粉试剂。冻干试剂是先将各种化学试剂溶解混合后，分装成不同试剂的瓶内，再经冻干处理。冻干试剂中残留的含水量不易精确控制，造成瓶间差较大。干粉试剂是用将各种干燥的化学试剂直接混合加工而成，各瓶内试剂中所含水量均一。冻干和干粉试剂在用前要复溶，复溶时对水质及其加入量要求很高，复溶后保存期短，稳定性差，常常造成浪费，同时不能抗干扰。第四阶
13、段：液体双生化试剂。准确、稳定性好；抗干扰能力强，无需复溶，使用方便，不易浪费，使用前无需准备，可直接上机使用，并适用于手工法。,双试剂的定义,双试剂是指将反应体系的全部试剂分成两大组分，即第一试剂先与被检样本中的干扰物质反应，使其被扣除，然后加入第二试剂，样本中的被检物质与反应体系中的试剂起反应，再进行测定。,双试剂的优点,1）抗干扰反应能力强在临床生化测定过程中，血标本本身成分十分复杂，除了含有待测物质外，还含有各种酶、有机物、无机盐等物质，这些物质都会干扰或参与测试反应，引起非特异性干扰反应。为了克服这种干扰反应，将试剂盒分为两组，在测定过程中，试剂1 与标本中的干扰物反应，使其消耗，再
14、用试剂2 启动真正的测试反应进行测定。,2）增强了工作试剂的稳定性,许多酶法测定试剂盒为冷冻干燥试剂，在4保存一般稳定期在1 年以上。但复溶后的工作试剂的稳定性差，如ALT 测定工作试剂4只能保存一周，AST 测定工作试剂4只可保存四天，而液体双试剂则使稳定性大大延长，如ALT、AST 测定的液体双试剂在4可稳定一年。液体酶法试剂从配制上解决了这一矛盾：a用户可根据每次标本量按一定比例配制适量工作液，当天配制当天用完这样便可减少试剂损失b如果用户使用的自动生化分析仪有双试剂测定功能，那么，就不必把双试剂混合成工作试剂进行测定，试剂的有效期一年便是工作液的有效期。c对于干粉、片剂型等需复溶的生化
15、试剂，水质的好坏直接影响了复溶后工作液的稳定性和测定重复性。目前除了一些三级医院有自制的试剂级的蒸馏水外，其他医院很难获得符合试剂级要求的水，这就对干粉、片剂试剂的实际使用造成了一定的影响。,3）提高了测定结果的重复性,试剂组分的高度均一性，提高了测定结果的重复性，避免了瓶间差，试剂中每一组分均一性是影响测定重复性的一个重要因素。,生化试剂产品分类,1.肝功能系列：ALT,ALP,AST,CHE、TB,PA.等 2.血脂系列:TG,LP（a）,HDL-C,LDC,ApoA1,ApoB 3.糖代谢系列:GLU,GSP,HbAIC等 4.肾功能系列:BUN,UA,CRE等 5.心肌酶系列:CK,C
16、K-MB,LDH,ADA等 6.胰腺系列:AMY 7.特种蛋白系列:CRP,RF,ASO,(PA),免疫球蛋白 8.微量原素系列：Ca，P,Mg，CO2 等,血脂系列,血脂：是指血浆中的甘油三酯（TG）和胆固醇(TC)及类脂（磷脂、糖脂、固醇、类固醇）的总称，血脂广泛存在于人体中，它们是生命细胞基础代谢的必需物质。 脂蛋白：由于甘油三酯和胆固醇都是疏水性物质，不能直接在血液中被转运，同时也不能直接进入组织细胞中。它们必须与血液中的特殊蛋白质和极性类脂(如磷脂)一起组成一个亲水性的球状巨分子，才能在血液中被运输，并进入组织细胞。这种球状巨分子复合物就称作脂蛋白。 载脂蛋白 :脂蛋白的蛋白部分称为
17、载脂蛋白,具有结合与转运脂质及稳定脂蛋白结构等功能.,血桨脂蛋白的分类（超速离心方法 ）,载脂蛋白 的分类,目前已报道的载脂蛋白有二十余种，而临床意义较为重要且认识比较清楚的有ApoAI、ApoAII、ApoAIV、ApoB、ApoCII、ApoCIII、ApoE、和Apo(a)。此外还有一种蛋白质称为胆固醇酶转移蛋白(CETP)，与血浆脂蛋白代谢的关系非常密切，亦属于载脂蛋白之列。血脂、脂蛋白、载脂蛋白测定己广泛应用于动脉粥样硬化(AS)性心血管病流行病学与临床，目前常用的检测项目共有7项TG、TC、HDL、LDL、ApoAI、ApoB、Lp(a)。,ApoAI 与ApoB 的临床意义,Ap
18、oB 是LDL的主要结构蛋白, LDL的主要生理功能是将所携带胆固醇运输到外周组织并沉积在那里,血液中LDL含量高是心血管发作的先兆.而ApoAI是HDL主要结构蛋白, HDL可以将组织中多余的胆固醇与磷脂清除出来,并运回肝脏进行处理,称之为胆固醇的逆向运输,血液中HDL含量高说明心血管发作的可能性很小.因此, 通过测定ApoB与ApoAI可直接反映LDL与LDL的含量,临床上常将ApoAI和ApoB的比值作为冠心病等心血管疾病的评价指标.,ApoB与ApoAI的测定,目前尚无公认的血清apoAI和apoB测定的参考方法 ,临床实验室普遍采用免疫透射比浊法(ITA )作为测定血清apoAI、a
19、poB的常规方法.市场上的诊断试剂盒大多为液体双试剂,配套全自动生化分析仪使用.原理为:血清中的ApoA1或apoB在液相中与相应的抗体相遇，立即形成抗原抗体免疫复合物，在特定的缓冲环境中形成浊度，其浊度在合适的抗体浓度存在时与抗原含量成正比，与相同操作的校准血清比较，即可求出样本中ApoA1或apoB的含量。,ApoB与ApoAI试剂盒的组份,试剂1 (R1):磷酸盐缓冲液(PH7.5,20mM/L) 、PEG 6000 、表面活性剂、防腐剂、稳定剂等.试剂2 (R2): 抗血清(羊抗人ApoB/ ApoAI) 、防腐剂、稳定剂等.校准品(S):校准血清1-4说明书,前白蛋白,概述：前白蛋白
20、（Prealbumin, PA），分子量5.4万，由肝细胞合成，其在血浆中的含量仅为白蛋白的1/10，在血清中的含量较少，其半衰期很短，仅约1.9天，在电泳分离时，常显示在白蛋白的前方而得名。PA是富含酪氨酸和色氨酸的四聚体，主要与甲状腺素结合，故又称为甲状腺素结合性前白蛋白或甲状腺转移素。PA除了作为组织修补的材料外，还可视为一种运载蛋白，它结合T4与T3，而对T3亲和力更大，PA能与视黄醇结合蛋白形成复合物，具有运载维生素A的作用。,前白蛋白的临床意义,除了作为一种灵敏的营养蛋白质指标，PA在急性炎症、恶性肿瘤、肝硬化或肾炎时其血浓度下降，在身体机能恢复后浓度又迅速回升，亦可作为肝疾病诊断
21、和预后估计的指标，血清中PA浓度的变化比白蛋白和转铁蛋白具有更高的敏感性。,前白蛋白的测定（免疫透射比浊法）,免疫比浊法是目前PA最常用的测定方法，简单快速，可以自动化批量分析，只需要自动生化分析仪，缺点是对抗血清的质量要求较高，且消耗抗血清较多；国内外现有商品化试剂盒中绝大部分采用免疫透射比浊法。,前白蛋白试剂盒的组份,试剂1 (R1):磷酸盐缓冲液(PH7.5,20mM/L) 、PEG 6000 、表面活性剂、防腐剂、稳定剂等.试剂2 (R2): 抗血清(羊抗人PA) 、防腐剂、稳定剂等.校准品(S):校准血清1-4说明书,实验的操作,基本参数的设定：主波长为340nm，副波长为700nm
22、，温度为37 .加样(2-3/7ul)、加试剂1 (300ul) 孵育3-5分钟，读取第一次吸光度（A1） 加试剂2 (75ul) 孵育5分钟，读取第二次吸光度（A2）计算A= A2 - A1 。试剂加样量可视不同仪器按比例增减 .,自动生化分析仪,自动生化分析仪是集自动化技术、光学、微电子技术学和计算机科学于一身，自动完加样、稀释、混合、反应、比色、分析过程的监控、数据记录、计算、打印等功能。根据仪器的结构原理不同，可分为连续流动式（管道式）、分立式、离心式和干片式四类；根据仪器的自动化程度不同，又可分为半自动生化分析仪和全自动生化分析仪。目前应用最多的为分立式自动生化分析仪。,分立式自动生
23、化分析仪的基本结构和功能,一、操作部分：主要由计算机和操作软件组成。二、测定部分：1）样品盘和样品架：用于放置标本、空白和标准液，大多数生化分析仪可直接放入标本试管而不用吸出血清；2）注射器：分标本针和试剂针两种，分别向反应杯中加入标本和试剂； 3）反应盘：带有反应杯的转盘，反应杯作为标本反应的场所，同时作为比色杯进行比色，常用的有塑料和石英两种； 4）试剂盘：用于放置实验项目所用到的试剂，试剂箱供放置试剂盘用，多有冷藏功能（4-15）；5）恒温装置：保证反应在合适的温度下进行，常用的温度有25 、30 、37 ，常见的恒温装置有水浴、油浴和空气浴三种；6）清洗单元：清洗反应完成后的反应杯，供
24、下一测定使用； 7）测定单元：监测反应液的吸光度，由光源、分光系统、检测器组成；常见的光源有氙灯和卤素灯，分光系统有前分光和后分光两种，现在多采用后分光技术，后分光的优点是可以同时选用双波长或多波长进行测定。,自动生化分析仪的校准（定标）方法,一、线性法：又称标准化法或K因数法，当物质的浓度和吸光度成比例变化时选用该法；原理是用标准品进行反应，测定吸光度的大小和变化量，根据Lamber-Beer(朗伯比耳 ) 定律A=KCL计算出因素K的大小，测定待测物的吸光度，主要适用于比色法测定的项目。二、非线性法：又称曲线拟合法，当物质的浓度和吸光度不成比例变化时选用该法，其原理是使用多个（3个以上）浓
25、度的校准品，在选定波长测定其吸光度值，利用浓度和吸光度的关系绘制非线性标准曲线，主要适用于免疫分析方法，如免疫透射比浊法。,一、线性定标,单点线性定标：又称因数法，只需提供1 个标准品定标公式：R（A）=KCL，只有1 个定标参数KK=R标/C标 定标曲线如下图两点线性定标：又称线性法，要求提供2 个标准品定标公式：R （A） =KCL+b，有两个定标参数，K 和b,二、非线性定标,主要包括Logistic-Log 4P（四参数对数）、Logistic-Log 5P （五参数对数）、Exponential5P （五参数指数）、Polynomial5P、Parabola（抛物线） 和 Splin
26、e（立方图）1) Logistic-Log 4P：要求提供至少4 个标准品，其中第1 个标准品的浓度为零，适用于随着浓度增加，其反应度增加越来越小的定标曲线，如下图2）Logistic-Log 5P：要求提供至少5个标准品其中第1 个标准品的浓度为零，适用于浓度增加到一定程度后，其反应度增加越来越大的定标曲线，如上图。,自动生化分析仪参数的设置,根据自动生化分析仪的开放程度分成封闭式和开放式两种，封闭式生化分析仪采用厂家仪器厂家的专用试剂和校准品，有需要人为设定分析参数，所有参数由厂家提供，开放式生化分析仪对用户开放，不限定试剂和校准品的选用，对于不同厂家的试剂和校准品，需要设定参数。常规设定
27、的主要参数如下：,一、波长（ Wavelength ）,根据颜色反应的光吸收曲线选取最大吸收峰作为主波长，如果在最大吸收峰处有干扰物质，为了消除干扰物质一般设定副波长，其选择原理为：干扰物在主波长和副波长处有相同或相近的光吸收，测定时主波长的吸光度减去副波长的吸光度可消除干扰物的干扰。,二、温度（Temperature）,自动生化分析仪一般有25 、30 、37 三种温度设置，为了使反应的温度和体内温度一致，一般选用37 。,三、分析方法（Assay Code）,生化分析仪的分析方法很多，常用的有：一点终点法（1Point，End）、二点终点法（2Point,End）、速率A法（连续监测法的一
28、种），对于具体的分析项目依据试剂的构成不同选择分析方法。双试剂测定的项目选用二点法，能消除标本空白和内源性的干扰，使分析结果准确性大大提高。,四、标本量和试剂量（Sample/Reagent Volume ),根据厂家提供的说明书设定标本量和试剂量。由于每一种生化仪需要的反应液量不同，需要对两者的比例进行同比例的增减。通常，为了提高灵敏度可减少标本量或增大试剂量，为了提高准确度可增大标本量或减少试剂量。,五、分析时间的设定,设定分析时间是参数设定中最重要的一步，设定的好坏可直接影响测定的准确性。对于一点法，分析时间设定为待测物质反应完成时进行测定，过早反应未完成，过长可能有其它干扰物产生干扰。对于两点法，第一点选择为标本和第一试剂混合后或第二试剂加入前，第二点选择为第二试剂加入完成时，两点的吸光度之差可消除空白和内源性的干扰。,六、线性范围判断,用于设定吸光度的最大和最小值。当吸光度在线性范围时，认为吸光度和物质浓度成正比，当吸光度小线性范围时，认为物质浓度太低，此时吸光度和浓度不成正比，需要以标本增量方式进行重新分析。同样当吸光度大于线性范围最大值时，认为物质浓度太高，需要以标本减量方式进行重新分析。,日立7020生化仪,东芝Accute TBA-40FR,岛津CL8000全自动生化分析仪,End,
