微生物学实验ppt课件.ppt

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1、微生物学实验,兰州理工大学生命科学与食品工程实验教学,显微镜概述 微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握不同显微镜的使用方法是很有必要的。 显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。,实验一 细菌形态结构观察和光学显微镜的使用,一、目的要求1.学习显微镜的结构、功能和使用方法。2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。,基础知识,尼康E-600显微镜,二、显

2、微镜的基本结构及油镜的工作原理,普通生物显微镜由3部分构成：照明系统：包括光源和聚光器。光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台(载物台) 、调节器和、物镜转换器(旋转器)。,与其他物镜不同，油镜需在载玻片与镜头之间加滴镜油，原因有二：1.增加照明亮度 油镜的放大倍数可达100 x，教具很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。为了不使通过的光线有所损失，必须造又精于加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油。通常用香柏油（n=1.52）.2.增加显微镜的分辨率 油镜的分辨率可达到0.2m左右。,2.荧光显微镜,尼康E800荧光DIC显微镜,

3、荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）,3. 激光共聚焦扫描显微镜,LCSM照片蓝色为细胞核，绿色为微管,4.暗视野显微镜 暗视野显微镜（dark field microscope）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。,一种介壳虫的染色体,5.相差显微镜6. 偏光显微镜 偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。,7.微分干涉差显微镜 DIC

4、显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。,DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）,8. 倒置显微镜,9. 透射电子显微镜,JEM-1011透射电子显微镜,莱卡超薄切片机,内质网透射电镜图（伪彩色）,冰冻蚀刻电镜照片,10. 扫描电子显微镜,JEOL扫描电子显微镜,人类血细胞SEM照片,11. 显微操作技术,尼康NT-88NE显微操作/注射仪,显微镜的分辨率: 也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离， 分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨 距离来表示的。 其计算公式为: D=0.61入/NA NA=n sin

5、a/2 式中D为分辨率，A为光波波长，NA为物镜的数值孔径(镜口率)。,在物镜上，有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表： 物镜 镜口率(N.A.) 工作距离(mm) 10 0.25 5.40 40 0.65 0.39 100 1.30 0.11,显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积， 公式为: M = K1xK2 焦点深度: 显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的 上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全 厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。,厚标本和薄标本,4 - 5 um,2um

6、,基础知识,三、 实验步骤,(一) 显微镜的使用1. 观察前的准备工作 (1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。 (2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。 (3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。,瞳 距 调 节,2. 显微镜的调节,屈 光 度 调 节,调节,粗 调 松 紧 调 节 旋 钮,聚 光 镜 中 心 调 节,孔径光栏调节,N.A聚=(0.6-0.8)N.A物,孔径光栏开度与图象,孔径光栏的运用,操作步骤如下: (1）可变光栏的

7、中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果可变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。 (2)载物台上放置观察标本，把聚光器上升到它上端透镜平面稍低于载物台平面的高度，并将它的可变光栏开到最大，用低倍物镜，进行调焦到能看见标本，可调反射镜使视野得到最亮和最均匀 的照明，或把光栏关小，最亮的照明区正处在视野的中央。 (3)转到高倍镜，并调焦到看清标本，然后去掉标本，拔出目镜，眼睛直接向镜筒观察，并把可变 光栏关小，看其亮点是否在视野中心，如果不是，就要转动聚光器的调节螺旋，把亮点调到视野中 央，再慢

8、慢开启可变光栏，使视野看到光栏边缘和聚光镜的边缘相接为止。,3. 观察操作(1) 低、高倍镜的使用: 先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片0.5cm处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰处，若要用高倍镜观察时，把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。,四、 注意事项1.低、高倍镜的使用。2.合轴调节。五、 实验结果1.熟练显微镜的调节。,六、 思考题,1.使用油镜时，为使么选用香柏油或液体石蜡作为物镜与玻片间的介质？其他液体行吗？2.油镜用毕后，为什么必须把镜油擦净？用过

9、多的二甲苯或用酒精擦镜有什么危害？3.什么是物镜的同焦现象？他在显微镜观察中有什么意义？4.观察时为什么要用左眼，并且两眼都应睁开？,实验二 细菌形态构造的染色观察,一、实验目的 1、掌握革兰氏染色、芽孢染色的原理及方法； 2、初步认识细菌的形态构造； 3、进一步熟练显微镜的使用方法。,二、材料与仪器,1、菌种： 大肠杆菌约1d、枯草芽孢杆菌2 d、枯草芽孢杆菌12-20h的 营养琼脂斜面培养物；2、染色液：革兰氏染色液、 5%孔雀绿溶液、0.5%番红水溶液；3、仪器：显微镜、载玻片、酒精灯等。,三 、实验原理（革氏染色法）,1、革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色法，通过此法染色，可

10、将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+)和革兰氏阴性菌（G-）两大类。2、制片（涂片，干燥，固定）初染（结晶紫、水洗）媒染（加碘液覆盖涂面）脱色（95%酒精、水洗，）复染（蕃红复染、水洗）干燥镜检,革兰氏染色与细胞壁：,肽聚糖,外膜,外膜蛋白,周质空间,1、革兰氏染色,1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染,2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细 胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。,3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。,4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如番红，它使原来无

11、色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色,四、实验步骤,革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌,2、芽孢染色,原理：细菌的芽孢壁致密，透性低，着色和脱色都比营养细胞困难。因此，一般采用碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽抱都同时染上色后，再用蒸馏水冲洗，脱去菌体的颜色，但仍保留芽饱的颜色。并用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可以在显微镜下明显区分芽饱和营养体的形态。,步骤：1、制片:按常规制片、干燥、固定。2、染色：加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，微火加热至冒蒸汽时，保持5min。切勿让涂片干枯。3、水洗至流出的

12、水无色为止。4、复染：用番红染液复染2min。5、水洗：用缓流水洗后，吸干。6、镜检：干后油镜观察。芽孢为绿色，芽孢囊及营养体为红色。,枯草芽孢杆菌的染色涂片,五 、注意事项 1、注意涂片不宜过厚； 2、火焰固定温度要适宜； 3、注意控制好脱色程度。,六 、思考题1、造成革兰氏染色结果不正确（假阴性或假阳性）的主要原因有哪些？2、在镜检时，如图片中的细菌呈红色，能否断定该细菌就是革兰氏阴性菌？3、用简单染色法是否能观察到细菌的芽孢？为什么？4、若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，什么原因？,实验三 酵母菌的形态观察,一、教学要求 学习并掌握形态观察及死活细胞的鉴别方法。

13、二、实验原理 酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比细菌大几十倍甚至十几倍。大多数以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式。,美蓝是一种无毒的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。,Scanning electron micrograph of the c

14、ommon bakers and brewers yeast Saccharomyces cerevisiae. Note the budding division and previous bud scars.,三、材料与器材,菌种: 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）麦芽汁（或豆芽汁）斜面培养物。试剂：0.05 和0.1 吕氏碱性美蓝染色液，革兰氏染色用碘液显微镜，玻片等,四 、操作步骤1、菌种活化将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，2528培养48 h左右备用。2、美蓝镜片的观察1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色掖，然后按无菌操作用接种环挑取少量酵母

15、菌苔放在染液中，混合均匀。,2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。4）染色约0.5h后再次进行观察，注意死活细胞数量是否增加。,5）用0.05%吕氏碱性美蓝染液重复上述操作。3、水一碘液镜片的观察在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。,、注意事项1、加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。2、盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。,

16、六、思考题1、吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？试分析其原因。2、在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？,实验四 酵母菌子囊孢子的观察,一 、教学要求 学习并掌握酵母菌子囊孢子的观察方法。二、基本原理 子囊孢子是子囊菌类真菌有性生殖产生的有性孢子。在酵母菌中，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件，所以对不同种属的酵母要选择适合形成子囊孢子的培养基。,Sexual spores,AscosporeFormed in a sac (ascus),三、材料与器材,菌种：同前.试剂：5孔雀绿水溶液，0.5番

17、红水溶液，95乙醇.显微镜，玻片等.,四、 操作步骤1、菌种活化将酵母移种至新鲜的麦芽汁琼脂斜面上，2528培养24h左右，然后再转种23次。 2、产孢培养将经活化的菌种转接到麦氏琼脂斜面上，2528培养约1周。 3、制片取经产孢培养的酵母斜面培养物，在净洁载玻片上按常规涂片、干燥、固定。,4、染色滴加5%孔雀绿染色1min。5、脱色用95%乙醇脱色30s，水洗。6、复染用0.5%番红复染30s，水洗，用吸水纸吸干。7、镜检干后用油镜观察（子囊孢子呈绿色，菌体和子囊呈粉红 色）。,五、注意事项 菌种活化时，要采用新配制、表面湿润的斜面培养基。六、思考题 如何区别酵母菌的营养细胞和释放出子囊外的

18、子囊孢子？,实验五 显微镜直接计数法,一、实验目的 掌握血球计数板的原理及使用血球计数板进行微生物计数的方法。 二、材料与器材,菌种：酿酒酵母 显微镜、血球计数板、盖玻片、酒精灯等。,三 、实验原理,显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计数器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血球计数板、peteroff-Hauser计菌器、Hawksley计菌器等。 设五个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，如果是25个中方格的计数把板，则： 1ml菌液中的总菌数=A/525104B =50000AB 16个中

19、方格的计数板，则： 1ml菌液中的总菌数=A/416104B =32000AB,四、 操作步骤,1、以无菌生理盐水将酿酒酵母制成适当浓度的菌悬液2、镜检计数室3、将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母液由该玻片边缘滴一小滴，让菌液靠毛细渗透作用进入技术室4、显微镜计数5、清洗血球计数板：镜检,五、注意事项切勿用硬物洗刷血球计数板，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。 六、思考题1、在滴加菌液时，为什么要先置盖玻片，然后滴加菌液？2、计算细菌数目时此法是否可以适用？,实验六 霉菌的形态观察与鉴定,一、目的：学习并掌握观察霉菌形态的基本方法。二、实验原理 霉菌可产生复什分支的

20、菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗的多（约3-10um)常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍。因此，用低倍镜即可观察。,The portion of the mycelium that anchors the mold and absorbs nutrients is called the vegetative mycelium ; the portion that produces asexual reproductive spore

21、s is termed the aerial mycelium,Bread Mold Spores on Fungal Fruiting Structure, Rhizopus sp. (SEM x2,990),Fungal Mycelium with Spores, Penicillium sp. (SEM x3,220),Black Mold, Aspergillus variecolor. (SEM x2,315),观察方法直接制片观察，载玻片培养观察，玻璃纸培养观察,三、材料与器材菌种：曲霉(Aspergillus sp.)、 根霉 (Rhizopus sp.)、青霉和 (Mucor

22、sp.)培养2-5 d 的马铃薯琼脂平板培养物试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液无菌吸管，平皿，载玻片，显微镜等,四 操作程序,直接制片观察：于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸液于载片中央，用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置于液滴中，再细心地将菌丝挑散开，然后小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡。置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜。,载玻片培养观察法：（1）培养小室的灭菌（2）琼脂块的制作（3）接种（4）培养（5）镜检,五、注意事项挑菌和制片时要细心，尽可能保持霉菌自然生长状态。加盖玻片时切勿压入气泡，以免影响观察。六、思考题青霉和曲霉的形态有哪些异同？细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的主

23、要区别是什么？,实验七 微生物大小的测定,一、实验目的 1. 学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2. 增强微生物细胞大小的感性认识。二、实验原理 微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊工具测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺适用于校正目镜测微尺每个的相对长度。然后，根据微生物细胞相当于目镜测微尺的个数，即可计算出细胞的实际大小。,三 、材料与器材,1、菌种 酿酒酵母24h马铃薯培养物 2、显微镜 目镜测微尺 镜台测微尺 载玻片 盖玻片等,四、 操作步骤,1、装目镜测微尺 2、校正目镜测微尺 装镜台测微尺：

24、校正： 计算：已知镜台测微尺每格长10um，根据下列公式即 可分别计算出在不同放大倍数下，目镜测微尺每个所代表的长度。 目镜测微尺每格长度(m)=两重和线间镜台测微尺格数*10/两重和线间目镜测微尺格数 3、菌体大小测定 4、测定完毕后，取出出目镜测微尺用擦净纸擦干 净，放回盒内保存。,五、注意事项换高倍镜和油镜时，防止接物镜压坏静台微尺和损坏镜头六、思考题为什么更换不同放大倍数的目镜和物镜时，必须用静台测微尺重新对目镜测微尺进行校正。,实验八 培养基的配制与灭菌,一、 教学要求通过配制牛肉膏蛋白胨等培养基，掌握配制培养基的一般方法和步骤。了解采用的灭菌方法和原理，掌握高压蒸汽灭菌技术。二、

25、实验原理 牛肉膏蛋白胨培养既是一种应用广泛和徐普通的细菌基础培养基，又成为普通培养基。这种培养基中含有一般细菌生长所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨提供氮源和维生素，氯化钠提供无机盐。,三、实验材料与器材,培养基：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、1mol/L NaoH、1mol/L HCl、黄豆芽、蔗糖（或葡萄糖）器材：玻璃器皿、天平、pH试纸、灭菌锅等,四、操作步骤,称量溶解调pH *（过滤*）分装*加塞*包扎高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌灭菌操作步骤： 首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相

26、平为宜。,放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。开启电源加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 1.05 kg/ cm2 ，121.3 ，20 min灭菌。,灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压

27、力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。将取出的灭菌培养基放入 37 温箱培养24 h，经检查若无杂菌生长，即可待用。,五、注意事项 培养基分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 使用灭菌锅应严格按照操作程序进行。灭菌所需时间到后，要先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，才能打开排气阀。六、思考题在配制培养基的操作过程要注意哪些问题？高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排

28、尽？,实验九 平板菌落计数,一、 教学要求 掌握平板菌落计数的原理和方法二 、实验原理 平板菌落计数是将待测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，去一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，一个菌落就可以看成是由一个细胞繁殖而成的。,三、 材料与器材,无菌培养皿12套、1 mL无菌移液管10 支、酱油样品、天平等。,四、 操作步骤,无菌平皿编号制备菌悬液 倾注平板 培养(48h) 计数,五、注意事项倒平板时要注意控制培养基的温度。稀释操作时，要尽量减少样品稀释误差，而且每个稀释度的菌液应各用一支无菌吸管。为使菌落能在平板上均匀分布，样品液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀。 六、

29、思考题要测定某种液体饮料中的活细菌总数，除了采用平板菌落计数法外，还可采用哪些方法？,实验十 产淀粉酶枯草芽孢杆菌的分离、纯化,一、 教学要求 通过从土壤中分离纯化细菌，初步掌握微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。,二、实验原理 枯草芽孢杆菌的多数中都能产生大量的淀粉酶，较易得到分离。由于芽孢具有较强的抗热能力，分离纯化时可采用热处理的方法，高温加热处理，杀死样品中所有不含芽孢的菌类，在培养过程中使芽孢杆菌得到很好的富集。利用该菌产淀粉酶的特性，选择以淀粉为碳源的分离培养基，菌体分泌的淀粉酶会使菌落周围的淀粉水解，滴加碘液即可在菌落周围出现清晰的透明圈。根据透明圈的直径（C）与菌落直径（H）之

30、比（C/H）可初步鉴定酶活力的高低，即比值越大酶活力越高，进而筛选出优良的生产用菌。,三、材料与器材,灭过菌的牛肉膏蛋白胨培养 0.02mol/L碘液 无菌生理盐水无菌培养皿6套/组、1 mL无菌移液管7 支、土壤样品、天平等。,四、 操作步骤 制备土壤稀释液,倾注平板,培养,接种和分离工具1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,挑菌落,isolation plate,移接斜面常用的接种方法划线接种点接种穿刺接种涂布接种液体接种注射接种,斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞好棉

31、塞,纯化（平板划线法）倒平板划线培养挑菌落纯种（纯培养）,平板划线分离的方法1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法,五、注意事项制备土壤稀释液时，要注意使土样均匀分散在稀释液中。 注意无菌操作。六、思考题如何检验平板上某个单菌落是不是纯培养？,实验十一 多管发酵法测定水中大肠菌群,一、教学要求 1、学习测定水中大肠菌群数量的多管发酵法； 2、了解大肠菌群的数量在饮水中的重要性。,二、实验原理大肠菌群系一群一大肠埃希氏菌(E.Coli)为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌，在37生长时，能于48小时内发酵乳糖使之产酸产气。主要包括埃希氏菌属(Escherichia)

32、、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)等。,该类细菌是肠道内的常居菌，主要寄居在人及温血动物的肠道内，不断随粪便排泄出来，因而在自然界环境中所存在的大肠菌群，都可以认为来自粪便。对水和饮食等物质卫生情况的判断，常以所含的大肠菌群的多少作为依据。如大肠菌群细菌越多。表示受粪便污染的程度越大，也就是受肠道中病原菌随粪便侵入的可能性越大。因此在各种物质的卫生细菌学检查中，非但要检查大肠菌群的有无，同时要检查大肠菌群存在的数量，来判断物质受粪便污染的程度。,多管发酵法包括初(步)发酵实验、平板分离和复发酵实验三个部分。1、初

33、(步)发酵实验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管，乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气，为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，溴甲酚紫还有抑制其他细菌如芽孢细菌生长的作用。,水样接种于发酵管内，37下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在少量的情况下，也可能延迟到48小时后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做

34、下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48小时后仍产气的阳性结果。,2、平板分离 平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基，Endos medium）或尹红美蓝琼脂(eos in methylene blue agar,EMB agar),前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长，尹红美蓝琼脂平板含有与美蓝,EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽,大肠杆菌测定EMB选择性分离鉴别

35、,染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色(龙胆紫的紫色)菌落。初发酵管24小时内产酸产气和48小时产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。,3、复发酵实验 以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏染色阴性无芽孢杆菌者，通过此实验再进一步证实。原理与初发酵实验相同，经24小时培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。,三、器材 1、培养基：乳糖蛋白胨发酵管(内有倒置小套管)，三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管(瓶)( 内有倒置小套管)，尹红美蓝琼脂平板； 2、材料：无菌水、载玻片、灭菌带玻璃塞

36、空瓶、无菌吸管、无菌试管等。,四、操作步骤： (一)水样的采取 1、自来水 先将自来水龙头用火焰烧灼5分钟灭菌，再开放水龙头使水流5分钟后，以灭菌三角瓶接取水样，以待分析。 2、池水、河水或湖水 应取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，拔去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。,(二)自来水检查 1、初(步)发酵实验 在2个含有50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵瓶中，各加入100ml水样；在10支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样(见图)。摇匀后，37下培养24小时，24小

37、时未产气的继续培养至48小时。 2、平板分离 经24小时培养后，产酸产气及48小时产酸产气的发酵管(瓶)，分别划线接种于尹红美蓝琼脂平板上，再于37下培养18-24小时，将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。,深紫黑色、有金属光泽。紫黑色、不带或略带金属光泽；淡紫红色、中心颜色较深。3、复发酵实验 经涂片、染色、镜检，如为革兰氏染色阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1-3个，37下培养24小时，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。根据初发酵的阳性管(瓶)数查表，即得大肠菌群数,五、思考题 在EMB培养基上长出的三种特征的菌落，何种为典型大肠杆菌？为什么？,