专题一基因工程.ppt

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1、专题一-基因工程,专题一-基因工程,一、DNA重组技术的基本工具,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1.分布：,2.特点：,特异性，即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且切割每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，使之断开。,主要从原核生物中分离纯化出来,一、DNA重组技术的基本工具（一）限制性核酸内切酶“分子,G A A T T C,C T T A A G,G,C T T A A,G,A A T T C,C C C G G G,G G G C C C,C C C,G G G,G G G,C C C, ,中轴线, ,EcoR（在G与A之间切割）,Sma（在G与C之间切割

2、）,粘性末端,平末端,切割DNA分子产生的两种不同的末端（箭头表示酶的切割位点）,3. 结果：在识别序列中轴线两侧切割，产生粘性末端； 在识别序列中轴线处切割，产生平末端。,G A A T T CC T T A A GGC T,（二）DNA连接酶“分子缝合针”,GC T T A AA A T T CGGC T T A A,（二）DNA连接酶“分子缝合针”,GC T T A AA A T T CG（二）DNA连接酶,（二）DNA连接酶“分子缝合针”,2.连接酶的部位：,磷酸二酯键，不是氢键,1.连接酶的作用：,将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子,（二）DNA连接酶“分

3、子缝合针”2.连接酶的部位：磷酸二,3.连接酶的类型（按来源分类）,(1) E.coli DNA连接酶：(来源于大肠杆菌),只能连接双链DNA片段互补的粘性末端,(2) T4 DNA连接酶：（来源于T4噬菌体）,既可以连接双链DNA片段 互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,3.连接酶的类型（按来源分类）(1) E.coli DNA连,（三）基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,1.作用：,2.条件： 能在宿主细胞内复制并稳定地保存； 具有多个限制酶切位点,便于目的基因插入； 具有标记基因，便于筛选； 必需是安全的，对宿主细胞无害。,将外源基因送入受体细胞,（三）基因进入受体细

4、胞的载体“分子运输车”1.作用：2.,3.种类：,质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒,质粒细菌拟核DNA之外能自主复制的小型双链环状DNA分子；DNA分子上具有多个限制酶切割位点；能在宿主细胞中进行自我复制；DNA分子上具有特殊的标记基因；对宿主细胞无影响。,3.种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒质粒,二、基因工程的基本操作程序,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,二、基因工程的基本操作程序获取目的基因构建表达载体导入受体细,（一）目的基因的获取,1.从基因文库中获取目的基因,（1）基因组文库,将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受

5、体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。,（2）部分基因文库,受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。,（一）目的基因的获取1.从基因文库中获取目的基因（1）基因组,（3）基因文库的构建,基因组文库的构建,提取某生物全部DNA,用适当限制酶切割,许 多DNA片段,与载体连接导入受体菌群,该生物基因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,cDNA文库的构建mRNA反转录形成,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,

6、双链DNA,与载体连接导入受体菌群,该生物cDNA文库,（3）基因文库的构建基因组文库的构建提取某生物用适当许 多与,2.利用PCR技术扩增目的基因,(1) 原理,PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。,2.利用PCR技术扩增目的基因(1) 原理 PCR是聚,专题一-基因工程,2. 过程,高温变性(DNA解旋)（9095）,低温退火(引物结合)（5560）,中温延伸(互补链合成)（7075）,双链DNA是在高温

7、条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。,多次重复,3.特点：指数形式扩增,2. 过程高温变性(DNA解旋)（9095）低温退火(引,推测,推测,合成,3.通过DNA合成仪直接合成目的基因,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的基因,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,推测推测合成3.通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪,（二）基因表达载体的构建,用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子

8、，即基因表达载体。,（二）基因表达载体的构建 用限制酶切割质粒使,质粒,目的基因,限制酶,（二）基因表达载体的构建,质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA（二）基因表达载体的,1.构建目的,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。,2.构建零件及其作用,（1）目的基因,（2）启动子 RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。,（二）基因表达载体的构建,1.构建目的 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗,（3）终止子 一段特殊结构的DNA片段，位于基

9、因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。,（4）标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,（二）基因表达载体的构建,2.构建零件及其作用,(5) 复制原点,（3）终止子 一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作,（三）将目的基因导入受体细胞,将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。,基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。,导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。,（三）将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞并,（1）农杆菌转化法,1.导入植物细

10、胞,（2）其他方法,基因枪法 花粉管通道法,（1）农杆菌转化法1.导入植物细胞（2）其他方法 基因枪法,移 植,显微注射,分裂分化,发育,2.导入动物细胞,(显微注射技术),含目的基因的表达载体,动 物 的受 精 卵,含目的基因的受精卵,早 期胚 胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因动 物,移 植显微分裂发2.导入动物细胞(显微注射技术)含目的基因,3.导入微生物细胞,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。,(2)常用受体细胞 大肠杆菌（E.coli）,(1)过程,制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易于接受外源DNA分子。,重组DNA分子与感受态细胞混合孵

11、育，完成转化。,(Ca2+ 处理法),3.导入微生物细胞 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,（四）目的基因的检测与鉴定,目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。,常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。,（四）目的基因的检测与鉴定 目的基因是否真正插入受,适当限制酶切割,用同位素标记的目的基因片段杂交,1.分子水平,（1）检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,提取受体生物全部DNA,许多DNA片段,显 出杂交带,（表明目的基因已插入）,（分子杂交技术）,适当限制用同位素标记的1.分子水平（1）检测转基因生物

12、的染色,专题一-基因工程,(2) 检测目的基因是否转录出了mRNA,提取受体生物的mRNA,用同位素标记的目的基因片段杂交,显 出杂交带,（表明目的基因已转录出了mRNA）,检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。,1.分子水平,（分子杂交技术）,(2) 检测目的基因是否转录出了mRNA 提取受体生用同位素,（3）检测目的基因是否翻译出蛋白质,（抗原抗体杂交技术）,提取受体生物的蛋白质,与相应抗体杂交,显 出杂交带,（表明目的基因已形成蛋白质产品）,1.分子水平,（分子杂交技术）,（3）检测目的基因是否翻译出蛋白质 （抗原抗体杂交技术）提,2.个体水平,

13、例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,2.个体水平例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说,1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述 不正确的是 （ ） A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒 B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达 C.DNA连接酶和 RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶 D.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒,C,2.下列关于基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（ ）A.一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B.

14、限制性内切酶的活性受温度的影响C.限制性内切酶能识别和切割RNAD.限制性内切酶可从原核生物中提取,C,1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述C2.,含重组质粒土壤农杆菌,A构建,土壤农杆菌,导入,B培养选择,侵 染,3.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。,请据图回答：（1）A过程需要的酶有_。（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是 _。（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加 入_。（4）如果利用DNA分子杂交原理

15、对再生植株进行检测，D过程应该用 _ _ _作为探针。,限制性内切酶和DNA连接酶,具有标记基因；能在宿主细胞内复制并稳定保存,卡那霉素,放射性同位素（或荧光分子）标记后的抗虫基因,含重组质粒土壤农杆菌抗虫基因含kan质粒重组质粒A土壤农杆菌,（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔 遗传规律。将转基因植株与_杂交，其后代中抗卡那 霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型 的数量比为_。若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得 的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占_%。,含重组质粒土壤农杆菌,抗虫基因

16、,含knar质粒,重组质粒,A构建,土壤农杆菌,导入,B培养选择,侵 染,非转基因植株,3：1,100,（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔,三、基因工程的应用,（一）植物基因工程,抗虫转基因植物抗病转基因植物抗逆转基因植物改良植物品质,如 转基因抗虫棉（水稻） (减轻农药对环境的污染),抗病毒（细菌、真菌）转基因植物， 如 抗病毒转基因小麦、 抗病毒转基因烟草等,如 转鱼抗冻蛋白基因番茄、 转基因抗除草剂玉米,如 富含赖氨酸的转基因玉米、 转基因延熟番茄,三、基因工程的应用（一）植物基因工程抗虫转基因植物如 转基因,（二）动物基因工程,三、基因工程的应用,提高动物生长

17、速度改善畜产品的品质生产药物做器官移植供体,如 转生长激素基因鲤鱼,如 低乳糖转基因牛（转肠乳糖酶基因）,如 乳腺生物反应器,利用基因工程改造供体器官，抑制或去除供体器官抗原决定基因的表达，获得没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官,（二）动物基因工程三、基因工程的应用提高动物生长速度如 转生,（三）基因工程药物,三、基因工程的应用,利用基因工程技术，通过微生物生产蛋白质类药品。,生长激素干扰素胰岛素,（三）基因工程药物三、基因工程的应用利用基因工程技术，通过微,（四）基因治疗,三、基因工程的应用,基因治疗就是将正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗是治

18、疗遗传病最有效的手段。,（四）基因治疗三、基因工程的应用 基因治疗就是将正常基,体外基因治疗,从病人体内获得某种细胞，进行培养，在体外完成基因转移，筛选成功转移的细胞扩增培养，再重新输入患者体内的治疗方法。,（四）基因治疗,体内基因治疗,直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。,体外基因治疗 从病人体内获得某种细胞，进行培养，在体外,SCID的基因工程治疗,SCID的基因工程治疗,四、蛋白质工程,以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。,四、蛋白质工程 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的,四、蛋白质工程,（一）原理,（二）过程,基因DNA,生物功能,预期功能,DNA合成,分子设计,中心法则的逆推,四、蛋白质工程（一）原理（二）过程基因生物功能预期功能mRN,感谢聆听,感谢聆听,