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1、临床微生物检验技术进展,临床微生物检验技术进展,一、临床微生物病原体的快速诊断,尽管对“快速”的时间长短没有正式的定义,然而大多数人期望快速的系统能在4h内提供可用的结果。通常微生物的繁殖时间(通常是30min或更长时间)不允许那些依赖微生物生长与否的检测方法,在短时间内产生可检测的生化反应。为了克服这一问题,必定使用全新的底物,检测待测菌产生的酶或蛋白质,从而在14h内检测出应答反应。,一、临床微生物病原体的快速诊断尽管对“快速”的时间长短没有正,(一)细菌与真菌的快速诊断1、质谱技术传统的形态学检测技术经典的利用酶学的生化反应技术 生化反应 编码技术 碳指纹技术质谱技术(MALDI-TOF
2、 MS),(一)细菌与真菌的快速诊断,Bruker Daltonik,microflex Biotyper (Billerica, MA, USA)bioMerieux Vitek MS (Durham, NC, USA)the Andromas SAS (Paris, France)、 The former two instruments are available in the USA and received clearance from the Food and Drug Administration (FDA) for certain groups of microorganisms
3、、,Bruker Daltonik,microflex Biot,临床微生物检验技术进展-课件,临床微生物检验技术进展-课件,(1)在需氧/兼性厌氧的革兰阳性杆菌应用棒杆菌属菌可准确鉴定。MALDITOF MS能够鉴定分枝杆菌,这种检测需要特别处理以杀灭待测菌(出于安全等考虑)、打散细胞聚集团块以及裂解细胞外壁(envelopes)等。MALDITOF MS应该能够鉴定大多数临床相关的分枝杆菌菌种。,(1)在需氧/兼性厌氧的革兰阳性杆菌应用,(2)在需氧/兼性厌氧的革兰阳性球菌应用MALDI-TOF MS对葡萄球菌(Staphylococci)、-溶血性链球菌(b-hemolytic stre
4、ptococci、气球菌(Aerococci和肠球菌(Enterococci)的整体鉴定性能都是极佳的。而对一些-溶血性链球菌(a-hemolytic streptococci)有困难。,(2)在需氧/兼性厌氧的革兰阳性球菌应用,布鲁克系统估计难以区分缓症链球菌(S、 mitis)、口腔链球菌(S、 oralis)与肺炎链球菌(S、 pneumoniae) ;而VITEK MS系统则能够克服这一局限。尽管MALDI-TOF MS在种群水平上能够可靠地鉴别草绿色链球菌(viridans group streptococci),但它估计无法区分一些紧密相关的种。其它链球菌,如乳链球菌(S、 can
5、is)、停乳链球菌停乳亚种(S、dysgalactiae)、化脓性链球菌(S、 pyogenes)和S、infantarius、马肠链球菌(S、 equinus)和S、lutetiensis等,相互估计无法特别好地区分开来。,布鲁克系统估计难以区分缓症链球菌(S、 mitis)、口腔链,(3)在需氧/兼性厌氧的革兰阴性杆菌应用阴沟肠杆菌复合体植生拉乌尔菌、解鸟氨酸拉乌尔菌巴策尔弓形杆菌弯曲杆菌种小肠结肠炎耶尔森菌二氧化碳嗜纤维菌洋葱伯克霍尔德菌气单胞菌HACEK菌群,(3)在需氧/兼性厌氧的革兰阴性杆菌应用,沙门菌属内鉴定通常是不可行的,然而它可区分 Salmonella enterica s
6、ubsp、 enterica serovar Typhi和其它S、 enterica serovars。Shigella and E、 coli are so closely related that Shigella is not identified by MALDI-TOF MS、 To differentiate, colonies should be examined for lactose fermentation,motility and a spot indole、 If positive an identification of E、 coli is appropriate、
7、 If negative for these tests, Shigella should be suspected and an agglutination with Shigella antisera performed、,沙门菌属内鉴定通常是不可行的,然而它可区分 Salmonel,(4)在厌氧菌应用MALDI-TOF MS技术可用于鉴定许多临床相关的厌氧菌。Jamal等报道使用布鲁克v3、3和生物梅里埃v1系统/v1、1数据库对274株常规分离厌氧菌(多属于Bacteroides fragilis)的鉴定准确率分别为89%和100%。,(4)在厌氧菌应用,(5)在酵母菌应用MALDI-
8、TOF MS能够鉴定酵母菌,且性能优于一些传统的表型鉴定系统。它能够鉴别都柏林假丝酵母菌(C、 dubliniensis)和白假丝酵母菌(C、albicans);皱折假丝酵母菌(C、rugosa)和近邹褶假丝酵母菌(C、pararugosa);挪威假丝酵母菌(C、norvegensis)、克柔假丝酵母菌(C、krusei)和平常假丝酵母菌(C、inconspicua、);近平滑假丝酵母菌(C、parapsilosis)、 C、orthopsilosis 和C、metapsilosis;带补充数据库时能够鉴别新生隐球菌(C、neoformans)和格特隐球菌(C、gattii)。,(5)在酵母菌
9、应用,(6)在丝状真菌应用丝状真菌的表型易变,其蛋白质谱可随生长条件及分析菌丝区域的不同而变化,目前的商业数据库少有涉及这些菌。De Carolis等人使用布鲁克Biotyper系统开发了曲霉菌(Aspergillus species)、镰刀菌(Fusarium species)和毛霉菌(Mucorales)的数据库,并用于94株菌的鉴定,其种水平的正确率高达97% 。 Iriart等人利用VITEK MS v1系统/v1、1数据库和直截了当上板测试操作,成功鉴定了44株曲霉菌中的82%的菌(包括数据库中存在的所有菌株)。,(6)在丝状真菌应用,(7)临床标本的直截了当检测血液感染尿液感染,(
10、7)临床标本的直截了当检测,2、细菌、病毒及其它病原体基因型快速诊断(1)DNA靶向测序关于纯培养的微生物能够进行DNA序列的靶向测序。靶基因的保守区往往是PCR引物和DNA测序引物退火结合的区域。可变区具有独特的核苷酸序列,从而实现基于测序的特定菌株属和种的鉴定。鉴定细菌最常用的靶序列是16S rRNA基因(16S rDNA)。,2、细菌、病毒及其它病原体基因型快速诊断,(2)电喷雾离子化质谱(ESI-MS)技术应用于PCR产物的分析它检测的是经PCR扩增后的广谱基因(例如rRNA)和特定基因的质量,而非细菌蛋白质的质量。电喷雾离子化质谱的检测精度能够确保通过检测扩增DNA的质量,精确地计算
11、出扩增DNA的核苷酸组分。,(2)电喷雾离子化质谱(ESI-MS)技术应用于PCR产物的,3、复合感染病原体的快速诊断PCR-液相芯片/固相芯片杂交技术。市场已见产品有Luminex xMAP和bioMrieux FilmArray。一次能够检测多个病原体(细菌、真菌、病毒与寄生虫);也能够检测不同类别的感染标本(血液、呼吸道分泌物、粪便与脑脊液)。,3、复合感染病原体的快速诊断,标记荧光素待测PCR扩增片段交联有基因探针的编码微球,二、临床微生物感染的快速诊断,1、G试验、GM试验、隐球菌荚膜多糖抗原由于广谱抗生素的使用、侵袭性操作、肿瘤放化疗及老年患者免疫功能的下降,导致侵袭性真菌感染不断
12、增加,真菌形态学及鉴定(生化反应)困难,有关侵袭性真菌感染需要开展G试验、GM试验、隐球菌荚膜多糖抗原检测。能够达到快速诊断侵袭性真菌感染并区分其感染的病原体。,二、临床微生物感染的快速诊断1、G试验、GM试验、隐球菌荚膜,2、内毒素与外毒素内毒素和外毒素是细菌产生的两大类毒素物质。内毒素是革兰阴性细菌细胞壁的组成成分,它是磷酸一多糖一蛋白质的复合物。主要成分为脂多糖。其性质较稳定、耐热、毒性比外毒素低、其作用没有组织器官选择性,不同病原菌所产生的内毒素引起的症状大致相同,都能引起机体体温升高、腹泻和出现出血性休克和其他组织损伤现象。外毒素是病原菌在代谢过程中分泌到菌体外的物质。产生外毒素的细
13、菌主要是一些革兰阳性细菌,少数革兰阴性菌如霍乱弧菌和产毒性大肠杆菌等也能产生外毒素。目前临床微生物检验能够开展的是内毒素,难辨梭状芽胞杆菌A、B毒素,幽门螺杆菌尿素酶、细胞毒素相关基因CagA和空泡毒素VacA的检测。,2、内毒素与外毒素,3、病原体IgM病原体感染刺激机体产生早期IgM和恢复期IgG,IgM关于快速的早期感染诊断具有一定价值,目前检测包括嗜肺军团菌(LP)、肺炎支原体(MP)、Q热立克次体(COX)、肺炎衣原体(CP)、腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IFA)、乙型流感病毒(IFB)、副流感病毒1、2和3型(PIVS)。,3、病原体IgM,4、超敏C反应蛋白、炎症细胞因子、PCT联合检测有助于感染类型的甄别。,4、超敏C反应蛋白、炎症细胞因子、PCT,三、病原体快速药敏试验,经典的药敏试验有K-B纸片扩散法、微量液体稀释法和E-test,孵育1824h判读结果,不能满足临床需要。dRAST通过微孔和微流控板,将细菌数量通过成像技术显示,常规细菌4h、结核分枝杆菌1周报告报告药敏结果。,三、病原体快速药敏试验经典的药敏试验有K-B纸片扩散法、微量,临床微生物检验技术进展-课件,临床微生物检验技术进展-课件,感谢您的聆听！,感谢您的聆听！,
