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1、化学发光原理及应用,化学发光原理及应用,主要内容,化学发光基本原理化学发光分析方法常见化学发光体系及其分析应用,2,主要内容化学发光基本原理2,Part I. 化学发光基本原理,一、化学发光原理：伴随化学反应的光发射现象 某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光(chemiluminescence) 。 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。,生物发光的本质是化学发光,3,Part I. 化学发光基本原理一、化学发光原理：伴随化
2、学反,1877年 洛粉碱CL1905年 洛粉碱类似物1928年 鲁米诺1935年 光泽精1960s PMT 出现 发现许多有机反应可产生CL,生物体化学发光现象的研究起源于古代，但是，直到十九世纪末，这种现象与简单的有机反应相联系才得到解释。,4,1877年 洛粉碱CL 生物体化学发光现象的研究起源,荧光产生的原理 入射光(h1)激发下的光发射现象,化学发光的原理 化学反应释放的能量(-G)使基态物质被激发而产生的后续光发射现象,1. 化学发光对应的能级跃迁,化学发光包含化学反应、能量传递以及后续激发态弛豫(与荧光一致)三个过程,5,化学反应化学发光h 荧光产生的原理 化学发光的原理入射光h,
3、2. 化学发光光谱,化学发光光谱与发光体的荧光发射光谱具有对应关系,6,2. 化学发光光谱化学发光光谱与发光体的荧光发射光谱具有对,化学发光光谱中避免了激发光源的干扰,7,化学发光光谱中避免了激发光源的干扰7,二、化学发光反应发生的条件,化学反应是放热反应。 化学反应的自由能的变化与发光波长的关系: G h / ex 2.857 10 4 千卡 / ex 摩尔 400750nm的可见光发射时所需要的G 的数值应在3871千卡(170300 kJ/mol)之间。必须存在形成电子激发态的通道。激发态分子必须以辐射光子的形式回到基态, 或将能量传递给荧光分子。,能量，通道，荧光物质,8,二、化学发光
4、反应发生的条件化学反应是放热反应。能量，通道，荧,2. 化学发光反应,直接化学发光A + B C* + DC* C + h1间接化学反应发光 A + B C* + D C* + F F* + C F* F + h2,*,*,*,9,2. 化学发光反应直接化学发光*9,电致化学发光现象 电致化学发光 (ECL) 是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。,多环芳烃化合物具有电致化学发光的特性,10,电致化学发光现象多环芳烃化合物具有电致化学发光的特性9,1,三、化学发光的表征,光谱：仅取决于体系的激发态动力学曲线（反应时间）化学发光
5、强度 化学发光强度取决于发光过程的量子产率(cl)反应速率(dc/dt)量子产率：凡是影响激发态荧光量子产率的因素都将对化学发光的量子产率产生影响 影响化学发光反应速率的物质也将影响体系化学发光的强度,灵敏度高，响应的物种数多，但是选择性差,11,三、化学发光的表征光谱：仅取决于体系的激发态灵敏度高，响应的,Part II. 化学发光分析法,使R过量,CA(t) = CA0 e-ktIcl(t) = cl V = cl kCA(t) = cl kCA0 e-k t,尽管A物质的 CA0 各不相同, 但 I 达到 Imax的时间相同. e-kt为常数. Icl(t) CA0 定量分析的依据,任何
6、对此过程产生影响的物质浓度都可能用化学发光法测定,一、化学发光分析法原理,12,Part II. 化学发光分析法使R过量CA(t) =,二、化学发光分析法流路,1. 分立式进样化学发光仪,这类仪器适合于选择性好, 量子效率高或发光体寿命长的化学发光反应的监测。不适用于快速化学发光反应(15S)的重现性监测。,暗室,13,二、化学发光分析法流路 1. 分立式进样化学发光仪PMTR1,2. 流动注射进样化学发光仪,几乎适用于所有 15s的快速化学发光反应并且可以增加合适的延迟流路或采用停流技术以适应长寿命的化学发光反应，所得的化学发光强度可以随时间积累,14,2. 流动注射进样化学发光仪几乎适用于
7、所有 15s的快,3. HPLC-CL联用技术,将化学发光高灵敏度的特点与HPLC高分离效率的优势结合，可以应用于复杂体系中多种痕量物质的定量分析，一般不需要复杂的衍生过程,暗室,15,3. HPLC-CL联用技术流动相A流动相B高压泵高压泵混合,Part III. 常见化学发光体系及其分析应用,鲁米诺化学发光体系 吖啶酯类化学发光体系 过氧化草酸酯类化学发光体系 无机物化学发光体系碱性高碘酸钾酸性高锰酸钾酸性硫酸铈稀土配合物(中性) 其他化学发光体系,16,Part III. 常见化学发光体系及其 鲁米诺化学发光体系,一、鲁米诺 (luminol)化学发光体系,量子产率： 0.150. 05
8、氧化剂: H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 Fe(CN)63-.催化剂: 过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+ etc.)间接测定：在生物酶作用下与O2生成H2O2的葡萄糖和氨基酸以及相应的酶,1. 化学发光原理氧化还原型,max = 425 nm,17,一、鲁米诺 (luminol)化学发光体系量子产率： 0.,2. 邻菲罗林 (1,10-phenanthroline),氧化剂: H2O2 催化剂: Cu2+ Co2+ Pb2+ Fe3+ Ni2+抑制剂: 蛋白质与Cu2+形成络合
9、物,18,2. 邻菲罗林 (1,10-phenanthroline)氧,二、吖啶酯类化学发光体系,代表性物质：光泽精 (lucigenin),氧化剂：H2O2；还原剂 + O2 还原剂：乳酸 尿酸 抗坏血酸催化剂：过渡金属离子、酶抑制剂：酚类物质对此反应有抑制作用间接测定：能够生成H2O2的基质及相应的酶,max = 445 nm,量子产率高，易于标记，是发展化学发光免疫分析和DNA发光探针的重要标记物,19,二、吖啶酯类化学发光体系 代表性物质：光泽精 (luci,三、过氧化草酸酯(TCPO)类化学发光体系,化学发光原理能量传递型,氧化剂：H2O2,背景发光：max = 440 nm, 55
10、0nm,发射波长：取决于共存荧光物质,20,三、过氧化草酸酯(TCPO)类化学发光体系化学发光原理能,四、碱性高碘酸钾化学发光体系,氧分子对的发射： 490 500 nm CO2双分子发射： 430 450 nm,化学发光原理活性氧中间体型,林金明 Analytical Chemistry 2002,多酚类物质对该体系的化学发光有增强作用,21,四、碱性高碘酸钾化学发光体系 氧分子对的发射：化学发光原理,五、酸性高锰酸钾化学发光体系,1. KMnO4 还原剂 CL体系KMnO4 + Red Intermediate (激发态) 直接CL Fluorophore Fluorophore (激发态
11、) 间接CL,还原剂：氨基酸、SO2、碘、药物、毒品等具有还原性的物质,量子产率不高，可以加入强还原性物质增强体系灵敏度,可以测定化学需氧量 Talanta 2003, 61, 651-658,22,五、酸性高锰酸钾化学发光体系1. KMnO4 还原剂,六、其他化学发光体系,1. 高价铈 CL体系Chemiluminescence of Ce (IV) and surfactant Tween 20 Analyst, 2001, 126, 553一些多酚类和胺类物质对该体系有增强和抑制作用,23,六、其他化学发光体系1. 高价铈 CL体系Organic,2. 气相 CL体系 Journal o
12、f Chromatography A, 842 (1999) 267308 以N的氧化物为例,O3 + NO O2 + NO2*NO2* NO2 + hv ( = 6002800 nm)Light intensity NOMeasurement of NO23NO2 + Mo 3NO + MoO3 (reduction)Total NO (initial + reduced NO2) = NOxNO2 = NOx NO,450C,(Catalyst),24,2. 气相 CL体系 O3 + NO,臭氧法测定N的氧化物,能够与臭氧反应产生化学发光的物质：不饱和脂肪烃和芳香族化合物；含有N，S等杂原
13、子的化合物；卤代有机酸和卤代烷烃；N的氧化物和CO；金属有机化合物；细菌。,25,臭氧法测定N的氧化物能够与臭氧反应产生化学发光的物质：25,3. 萤火虫发光 (firefly BL),max = 562 nm,此反应重要的分析对象是ATP 10-1110-14mol,4. 细菌发光 (bacterial BL),还原型吡啶核苷酸黄素,主要分析物 FMN 10-12mol此反应常用于NADH和NADPH试验 10-15mol,max = 490nm,26,3. 萤火虫发光 (firefly BL)max = 5,5. 化学发光免疫分析,竞争法：（检查小分子抗原多采用） 启动发光试剂 Ag +
14、Ag-L + Ab Ag-Ab + Ab-Ag-L h 首先将待测抗原与CL标记的抗原混合均匀，再与抗体发生竞争反应结合，并将未被吸附的抗原洗掉。由于抗体的浓度已知，标记抗原的浓度可以由化学发光强度测定，二者的差值即被测抗原的浓度。,27,5. 化学发光免疫分析竞争法：（检查小分子抗原多采用）27,化学发光免疫分析仪,28,化学发光免疫分析仪28,本章小结：化学发光分析的特点,不需要外部光源：消除了入射光的干扰(瑞利散射和拉曼散射)。克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降低了噪声，提高了信噪比。 灵敏度高(通常可达ng级或pg级)。线性范围宽(通常可达三个数量级)。设备简单、分析快速、易实现自动化。,局限性：方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器商品化不够,29,本章小结：化学发光分析的特点不需要外部光源：局限性：方法选择,
