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1、免疫标记技术,Immunolabeling technique,第一节 免疫标记技术的基本概念,一、免疫标记与标记免疫的概念二、常用的免疫标记物质,免疫标记与标记免疫,免疫标记技术：标记物与免疫活性物质的联接技术标记免疫技术：以标记免疫物质检测相应靶物质的技术,免疫标记技术 =,免疫技术+ 标记技术,酶,荧光素,同位素,其它,常用的免疫标记物质,类别 标记物 用途荧光素 FITC、RB200、TRITC 免疫组化 镧系元素螯合物 免疫分析测定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析测定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫组化 免疫分析测定化学发光物 Luminol、lucig
2、enin 免疫分析测定金属颗粒 胶体金、铁蛋白 免疫组化 免疫分析测定,第二节 标记免疫技术的分类,一、按指示标记物质划分的类型二、按测定方式划分的类型三、按测定用途划分的类型,1、酶免疫技术2、荧光免疫技术3、放射免疫技术4、金免疫技术,按指示标记物质划分的类型,1、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）,按测定方式划分的类型,均相型（homogenous）,非均相型（heterogeneous）,1、免疫测定技术2、免疫组化技术,按测定用途划分的类型,第三节 酶标记技术,一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与鉴定,常用标记方法,1、常用酶 辣根过氧化物酶（
3、HRP） 碱性磷酸酶（AP）2、标记方法 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法,戊二醛交联法 (一步法）,抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体,酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,戊二醛交联法（二步法）,COH-（CH2）3-COH + NH2-酶,抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶,抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶,过碘酸盐氧化法,NaIO4,O,O,OH,+ NH2抗体,O,O,O,N,
4、N,抗体,抗体,H2O,N,抗体,NaBH4,Schiff碱,酶-五炭糖环,标记免疫物的分离与鉴定,1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度,酶联免疫吸附实验enzyme linked immunosorbent assay （ ELISA ）,ELISA基本的实验过程,ELISA技术的原理与方法,间接法 夹心法 竞争法,间接法,夹心法,竞争法,第四节 荧光标记技术,一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化,常用标记方法,1、荧光素的概念2、生物标记荧光素的要求3、常用荧光素标记原理与方法,生物标记荧光素的要求,1、具有与蛋白质共价结合的能力2、荧
5、光效率高3、能与背景物质形成鲜明对比4、不影响蛋白质的生物、免疫活性5、标记方法安全、简便6、标记物稳定，易保存,荧光抗体技术的原理与方法,直接法间接法补体法双标记法,直接法,间接法,补体法,双标记法,标记免疫物的分离与鉴定,1、分离 目的：去除游离荧光素 方法：柱层析2、鉴定 抗体活性 标记物结合度 F/P比值的应用意义,第五节 放射性核素标记技术,一、常用标记方法二、标记免疫物的分离与纯化,直接法（氯胺T法）,Na125I 4。C,125I,氯胺T,间接法（连接法）,+ Na125I,氯胺T,125I,NSHPP,结合相,游离相,放射免疫分析法的原理与方法,常用标记方法,1、常用放射性核素
6、2、125I 的标记方法 直接法（氯胺T法） 间接法（连接法）,标记免疫物的分离与鉴定,1、分离 目的：去除游离放射性核素 方法：柱层析2、鉴定 游离放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）应用意义,第六节 胶体金标记免疫技术 (金标法),胶体金是由氯化金与还原剂反应形成的一种胶体颗粒，具有吸附蛋白质的特性(可以标记Ag或Ab)； 胶体金颗粒具有呈色性，中等大小的胶体金颗粒呈现酒红色。 胶体金标记免疫技术是将金颗粒光学检测的灵敏性和抗原抗体反应的特异性相结合。,胶体金免疫法与RIA、ELISA等方法相比,有许多优点：,1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和显色剂，使操作更简便;,2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;,3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有效期长;,4.灵敏度高。,免疫标记技术的比较,FIA ELISA RIA敏感性 较低 高 高特异性 高 高 高重复性 差 好 好检测对象 Ag/Ab Ag/Ab Ag,
