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1、分子生物学技术在肿瘤检测及治疗中的应用,Application of Molecular Biology Technology in Tumor Detection and Treatment,目 录,01,肿瘤的防治历史,P3,02,PCR技术简介及其衍生技术,P46,04,单管荧光定量PCR技术,P8,05,实时荧光定量PCR技术的优越性,P9,03,反转录聚合酶链式扩增 RT-PCR,P7,06,实时荧光定量PCR技术应用于肿瘤,P10,C,ONTENTS,2,肿瘤防治历史,半个世纪多以来，随着医学技术的发展，人类已经基本上控制了以往主要威胁人类健康的传染病，而肿瘤、心血管等疾病逐渐成为
2、人类健康的主要疾病，其中肿瘤的治疗尤为困难。传统的肿瘤治疗主要以外科手术为主，后期发展的化疗、放疗成为治疗肿瘤的主要方法。但在临床的实际应用上这些方法均有其局限性，疗效也不尽如人意。随着研究的深入，人们发现细胞基因的恶变是肿瘤发生的主要机制，在肿瘤研究领域的大量研究成果显示肿瘤的发生、发展、治疗和预后与肿瘤细胞内部基因有关。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR技术不但能有效的检测基因的突变，而且能准确检测癌基因的表达量，可据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。,3,PCR技术简介及其衍生技术,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction
3、）是一种分子生物学技术，模仿DNA体内复制的机制，在体外进行扩增特异的DNA片段。这种方法不必依赖大肠杆菌或酵母菌等生物体。这种技术是在模板DNA为引物，四种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。它可以在12h就能将所需基因扩增几百万倍，使极微量的所需DNA达到极易检测的水平。,随着PCR技术的逐步发展，其衍生技术也在以几块的速度发展，目前已达数十种。主要有逆转录PCR，多重PCR，免疫PCR，巢式PCR，荧光PCR，定量PCR等等。这些技术的发展不仅仅发展了PCR技术，而且在分子生物学和医学等领域的科学研究上带来了深刻的影响。特别是在与肿瘤有关的基因的分析上发挥着重要的作用
4、。,4,PCR的基本特点,01,高敏感性,灵敏度可达到Pg级，甚至达到Fg级水平，使极微量的单拷贝特定核苷酸在短时间内扩增到几百万倍。,02,高特异性,扩增的基因片段能与原基因片段保持不变。,03,操作简便,过去的方法完成一项试验少则几周，多则几个月。应用全自动DNA扩增仪，整个PCR过程均由电脑控制，只需数小时即可完成整个试验过程，对表本要求也不高，用极微量的粗制标本就可获取目的产物,5,01,02,03,04,05,06,检测恶性肿瘤特异性标志物,检测恶性肿瘤染色体易位,检测肿瘤相关病毒,检测基因重排,检测抗癌基因,检测活化的癌基因,PCR在肿瘤检测诊断方面的意义,6,反转录聚合酶链式扩增
5、 RT-PCR,RTPCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。 RTPCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。 作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随
6、机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发夹结构的真核细胞mRNA，3种都可。,7,单管荧光定量PCR技术,FQPCR的反应体系中除了普通PCR所需的引物外，还有一条荧光探针，探针的5端标记了荧光报告基团，3端标记了荧光淬灭基团，当这条探针保持完整时，荧光淬灭基团抑制荧光报告基团发出荧光。PCR反应开始后，随着DNA链的延伸，Taq酶的5-3外切酶活性将荧光探针切断，荧光淬灭基团的作用消失，荧光报告基团就发出了荧光信号，荧光信号的强弱与PCR的产物数量成正比，根据测量到的荧光信号强弱，通过分析软件得到样本的原始拷贝数。,单管荧光定量PCR（Fluorogenic Qua
7、ntitative PCR, FQ-PCR）技术是融合了PCR技术与DNA探针杂交技术的优点，实验的整个过程只在加样时打开1次反应管，在PCR的每个循环中可以直接监测到荧光信号的变化，根据PCR反应酶动力学特点分析软件会自动对DNA进行定量，因此也有人称FQ-PCR为实时荧光定量PCR（Real-time Fluorogenic Quantitative PCR）。,8,实时荧光定量技术的优越性,常规检测mRNA表达主要是RT-PCR技术，它是将mRNA分子的cDNA序列进行了扩增，从而为用非常少量的模板分析mRNA提供了可能。但这种常规的RT-PCR技术敏感性还不是很高，极大地限制了它在癌细
8、胞微转移方面的临床应用。实时荧光定量RT-PCR技术是基因时代一项用于检测mRNA的新技术，是临床检测和基础研究中不可缺少的重要研究方法，包括绝对定量PCR和相对定量PCR。实时荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR技术相比在特异性、灵敏度、精确性等方面都具有更大的优势，该技术的特点是可以减少PCR后操作，在比较不同浓度的mRNA方面具有非常宽的动力学范围。,9,实时荧光定量PCR技术应用于肿瘤,在肿瘤分子诊断上的应用肿瘤的本质是细胞内基因发生了改变，是一种多基因异常的疾病。癌基因表达变化在许多肿瘤早期和良性阶段就已出现，该技术不但能有效监测基因的表达变化，而且能 准确监测其表达量，可据此进行
9、肿瘤的早期诊断、分型、和预后判断。eg：端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病ER基因、肿瘤MDR1基因等的检测,肿瘤基因表达研究实时荧光定量RT-PCR方法能检测各种组织细胞中基因的表达丰度，从而分析基因的表达调控、监控mRNA的表达模式、检测组织中少量存在的基因、跟踪细胞群体中的克隆型、定量分析基因在不同组织中的转录水平。eg：检测黑色素瘤中的细胞因子白细胞介素-10（IL-10）、转化生长因子1、2（TGF-1、2）和干扰素（IFN-）的基因表达情况。,10,随着基因科学和分子生物学发展，各种PCR的技术的研究将会不断深入，成为未来分子生物学实验室的重要研究工具，在基础和临床医学研究领
10、域将会有更加广阔的前景。,11,1.PCR技术在肿瘤检测及治疗中的应用 1001-5116（2001）06-0049-032.Application of Fluorogenic Quantitave PCR in Tumor Research 2004，1(5)：323-3263.https:/zh.wikipedia.org/wiki/%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6%E9%93%BE%E5%BC%8F%E5%8F%8D%E5%BA%944.Application of Real-time Fluorescene Quantitative RT-PCR Technology to Cancer Research 1671-170X(2013)01-0069-03,12,参考文献,谢谢观看,13,
