分析化学高效液相色谱法ppt课件.ppt

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1、第二十章 高效液相色谱法,(HPLC),经典液相色谱法为基础，引入气相色谱法的理论和实验技术，高压输送流动相，高效固定相及高灵敏度检测器，现代液相色谱分析方法。,高效液相色谱法与经典液相色谱法,经典液相柱色谱装置,高效液相色谱仪,例：分离20种氨基酸,柱长：170 cm柱径：0.9 cmF：30 mL/ht分离: 20 h,经典柱色谱,HPLC,t分离：1 h,与经典液相色谱法相比,颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高；高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快；高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达109g，而荧光检测器最小

2、检测限可达1012g。,与气相色谱法相比,不受试样的挥发性和热稳定性的限制，应用范围广；可选用各种溶剂作为流动相，对分离的选择性有很大作用，选择性高；一般在室温条件下进行分离，不需要高柱温。,第一节 高效液相色谱法的主要类型 和原理,一、主要类型 四类基本类型色谱法 分配色谱法（partition chromatography）吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）,其他色谱类型亲合色谱法（affinity chromatography；AC）手性色谱法（chiral chromatography；CC）胶束色谱法（mi

3、cellar chromatography；MC）电色谱法（electrochromatography；EC）,二、化学键合相色谱法,以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC)化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相,优点：固定相的均一性和稳定性好，在使用过程中不易流失，使用周期长；柱效高；重现性好；能使用的流动相和键合相的种类多，分离的选择性高正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）键合相色谱法：根据化学键合相与流动相极性的相对强弱,（一）正相键合相色谱法

4、,固定相：极性键合相如氰基（CN）、氨基（NH2）或二羟基键合硅胶。（经典：水饱和的硅胶） 流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂如烷烃加醇类。（与水不混溶的溶剂）适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物如一些在硅胶柱上分离的物质,分离机制？ 分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解 吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用分离选择性：极性强的组分k大，后洗脱出柱。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k减小，tR 减小。,（二）反相键合相色谱法,固定相：非极性键合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）键合硅胶 流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水

5、混溶的极性调整剂 常用甲醇水、乙腈水等 适用范围：最广 非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等）,保留机制 疏溶剂 （solvophobic theory）,溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。不是溶质分子与键合相间的色散力。,保留行为的主要影响因素 1、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。 同系物碳数越多，极性越弱，k越大； 引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。2、固定相 键合烷基的疏水性随碳链的延长而增 加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶 质的k越大。,3、流动相 极性越强，洗

6、脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。,离子抑制色谱法（ion suppression chromatography；ISC ）用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使k变大。适用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱碱,反相键合相色谱法,把离子对试剂加入到含水流动相中，组分离子在流动相中与离子对试剂的反离子（counter ion）生成中性离子对，增加溶质与非极性固定相的作

7、用，使k增加，改善分离效果。,（三）反相离子对色谱法,离子对模型,3,3,+,+,(,),+,3,s,3,(,+,固定相,+,(,),+,B,),+,流动相,通式,影响容量因子的因素离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。,适用范围和离子对试剂的选择,适用范围：有机酸、碱、盐，离子型和非离子型化合物的混合物。分析酸类或带负电荷物质：用季铵盐，如四丁基铵磷酸盐（TBA）和溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）等。分析碱类或带正电

8、荷的物质：用烷基磺酸盐或硫酸盐，如正戊烷基磺酸钠（PICB5）、正己烷基磺酸钠（PICB6）。,第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择,固定相应符合下列要求：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压；化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。,一、化学键合相色谱法的固定相,（一）键合相的种类 非极性键合相 ：非极性烃基，如C18C8C1与苯基等键合在硅胶表面；用于反相色谱；长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高，稳定性更好。,键合相的种类弱极性键合相： 醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱极性键合相：常用氨基氰基键合相（氰乙硅烷基Si(CH2)2CN)键合硅胶一般用于正相色谱

9、特殊用途的键合相,（二）键合相的性质和特点,键合反应 硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应,如：YWGC18H37，无定形硅胶YWG上键合了十八硅烷基；Spherisorb ODS，球形硅胶Spherisorb 上键合了ODS。,键合相的性质和特点,键合相的性质含碳量：含碳的百分数 覆盖度 ：已反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例 封尾（end-capping）：在键合反应后，用三甲基氯硅烷等进行钝化处理，减少残余硅醇基。,键合相的特点使用过程中不流失；化学稳定性好；适于梯度洗脱；载样量大 注意：流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH范围的键合相

10、)。,固定相,硅胶表面结构,硅胶表面结构经热处理发生的变化,二、化学键合相色谱法的流动相,对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。对试样有适宜的溶解度。使k在110范围内，与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压，提高柱效。,（一）流动相对分离的影响n由色谱柱（固定相）性能决定，主要受溶剂种类的影响，k受溶剂配比的影响。,（二）流动相的强度和选择性溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 溶剂的选择性不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同 混合溶剂（二元或多

11、元流动相）,三、分离条件的选择,1、 色谱柱柱效的基本关系式,2、 分离度,3、 速率方程,溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一,流动相流速对板高的影响,小颗粒填料，填充均匀； 选择较低的流动相流速； 选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。,修正的速率方程：,提高柱效途径,流动相(洗脱剂),越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。,溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能,溶剂强度参数,硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯,流动相：干燥正庚烷,1份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷,水饱和的正庚烷,改变流动相的组成可改变分离的选择

12、性,4 应用,具有不同官能团的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合物异构体,例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：,邻位间位对位,适合分离的物质,一、液固吸附色谱Liquid-Solid Chromatography,m,ad,ad,m,nM,X,nM,X,+,+,以样品中各组分在固定相上的吸附作用不同来进行分离,“相似相溶”原理异构体的分离,二、液液分配色谱Liquid-Liquid Chromatography,Ki,Stationary phase,Mobile phase,固定液易流失 化学键合固定相,三、分配色谱法,分离原理,K不仅与固定相的种类有关，也与

13、流动相的种类有关,正相分配色谱,组分极性越大，保留时间越长,反相分配色谱,组分极性越小，保留时间越长,四、离子交换色谱法,阳离子交换树脂,阳离子交换,阴离子交换,1 分离原理,2 固定相,阳离子：SO3H(强)CO2H(弱)阴离子：N+R3(强)NH2 (弱),基质,合成树脂纤维素硅胶,离子交换剂,3 流动相,水相缓冲液+有机改性剂,调节选择性的主要参数,盐种类及浓度pH值,各种阴离子的在阴离子交换剂上的滞留次序：,用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快,4 应用,离子及可离解的化合物如氨基酸、核酸、蛋白质等,四 化学键合相色谱,采用化学键合相的液相色谱,固定相非常稳定，在使用中不易流失。由于可将各

14、种极性的官能团键合到载体表面，因此它适用于种类繁多样品的分离。,特点,1. 键合固定相制备,ODS(C18)键合相,硅胶,十八烷基氯硅烷,非极性,硅烷化反应,使用pH范围： 2-8,键合固定相类型,疏水基团烷烃（C8和C18）、苯基等,极性基团丙氨基氰乙基醚和醇等,离子交换基团胺基、季铵盐磺酸、羧酸,2. 键合相色谱法分类,反相键合相色谱:,常用固定相：C18,分离对象非极性中等极性化合物,常用流动相甲醇-水乙睛-水,反相键合相色谱疏溶剂分离机制,固定相极性流动相极性,正相键合相色谱 固定相极性 流动相极性,离子性键合相色谱将各种离子交换基团化学键合到硅胶基质表面上，就形成了离子性键合相色谱的

15、固定相。其分离原理与离子交换色谱类同。,例：甲苯和苯酚的分离。流动相：甲醇-水,出峰顺序：苯酚，甲苯,出峰顺序：甲苯，苯酚,十八烷基键合相,二醇基键合相,保留时间：,例：以ODS键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。,没食子酸,3,4-二羟基苯甲酸,固定相: 非极性; 流动相: 极性组分极性: 3,4-二羟基苯甲酸没食子酸,五 尺寸排阻(凝胶)色谱法,排阻色谱分离示意图,相对分子质量差别大于10的化合物才可以分离,1 分离原理,2 固定相,是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。,凝胶,3 流动相,不采用改变流动相组成的

16、方法控制分离度,分离方法的选择,第三节 高效液相色谱仪,高压泵,流动相溶剂,废液,色谱柱,进样口,检测器,一 高压输液系统,1 高压泵,要求输出压力高平稳、脉冲小流量稳定可调耐腐蚀,2 梯度洗脱装置,低压梯度,高压梯度,通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。,梯度洗脱,等度洗脱与梯度洗脱,梯度洗脱的特点,改善分离, 加快分析速度；改善峰形, 减少拖尾;可能引起基线漂移,分配比变化范围宽的复杂样品应采取梯度洗脱方式分离,3 贮液瓶及流动相,1) 对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2) 适用于所选择的检测器。3) 化学惰性好，以免破坏固定

17、相。4) 低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5) 纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。,对流动相溶剂的一般要求,二 进样系统,准备状态 进样状态,六通阀进样 装置,自动进样器,三 色谱柱,内径：16 mm，柱长：530 cm；柱填料粒径：5m,分离柱,四 检测系统,1 紫外吸收检测器,(a) 可变波长紫外检测器,(b) 二极管阵列检测器,氘灯,光栅,流通池,测量光电二极管,参比光电二极管,2 二极管阵列检测器,两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器,(b),(a),紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好 ，可用于梯度洗脱。 流动相选择有限制。,一些常用溶剂的紫外截止波长,3 荧光检测器,灵敏度高，选择性好，可用于梯度洗脱。,4 示差折光检测器,利用组分与流动相的折射率之差进行检测。,通用性好，灵敏度较低，不适用于梯度洗脱。,5 化学发光检测器,6 电化学检测器,电导检测器安培检测器,7 质谱检测器,第四节 高效液相色谱分析方法,定性分析方法定量分析方法：外标法、内标法同GC（自学）,