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1、常见的核酸分子诊断技术,?,核酸分子杂交,( Nucleic acid molecular Hybridization),?,基因芯片,（,Gene Chip,）,?,聚合酶链反应,( polymerase chain reaction reaction,；,PCR),核酸分子杂交的原理,?,双链核酸加热或经硷处理变性后，可解链成两条互补的单,链核酸。,?,在适当温度、盐浓度下，双链能按硷基互补配对原则,(A-,T,C-G),复性而重新成为双链核酸。,?,用已知序列的单链核酸，经标记制成核酸探针，与变性后,的待测标本核酸进行杂交，通过检测标记探针的信号，可,判断标本是否存在与探针互补杂交的同源
2、核酸。,核酸分子杂交探针的制备,制备探针的靶核酸可通过,:,?,分离、切割病毒的特定核酸片段获得,;,?,用重组技术，将该片段克隆到细菌质粒，经扩增和纯化大,量获得,;,?,选择已知病毒的一段基因序列，用人工方法合成寡核苷酸,，其长度以,20,个左右最为常用，过短易出现非特异性杂交,。,核酸分子杂交探针的制备,常见的用于标记探针的示踪物质,?,放射性核素如：,32,P,，,35,S,，,3,H,，,125,I,等，杂交后可通过放射,自显影技术进行检测,?,非放射性物质如：生物素、地高辛和酶等，杂交后可通过,底物显色、化学发光等技术进行检测,核酸分子杂交示意图,核酸分子杂交,的程序,常用的核酸分
3、子杂交技术,?,斑点杂交（,spot blot hybridization,）,?,凝胶电泳印迹转移杂交（,Southern,blot hybridization),?,原位杂交（,in,-,situ hybridization,）,斑点杂交,Dot Bolt,Hybridization for,HBV DNA,Quantitationin 5,l,of Patient Sera,(,Southernblot hybridization) (in-,situhybridization,）,核酸分子杂交技术的应用,?,核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该,技术在分子生物学领域中已广
4、泛地使用于克隆基因的筛选,、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性,等,?,在医学上，目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断，恶性,肿瘤的基因分析，传染病病原体的检测等领域中,。,基因芯片,基因芯片,（或,DNA Chip,或,Microarray,）又称,DNA,微阵,列，是指固定在固相载体上的,高密度,DNA,微点阵。即将大量,靶基因或寡核苷酸片段有序地,，高密度地（点与点间距一般,小于,500,m,）排列在玻璃、,硅等载体上，称之为基因芯片,。,上图显示大量的,DNA,探针，按照一,定的规律有序地排列在支撑物上,，每个探针与相对应的特异互补,序列结合后，即可发出荧光。利,用该芯片可同时获
5、取大量信息。,DNA Microarray,基因芯片技术原理,?,大规模集成的固相杂交,?,基本原理是核酸分子杂交，即依据,DNA,双链碱基互,补配对、变性和复性的原理,?,以大量已知序列的寡核苷酸、,cDNA,或基因片段作探针，检测,样品中哪些核酸序列与其互补，,然后通过定性、定量分析得出待,测样品的基因序列及表达的信息,基因芯片的作用原理,基因芯片的制作,方式,原位合成,直接点样,原位光蚀刻合成,原位喷印合成,分子印章法,针式点样,喷墨点样,光导原位合成法,基因芯片技术流程,基因芯片的应用,?,基因表达分析,分析基因表达,时,空特征,基因差异表达,检测,发现,新基因,大,规,模,DNA,测
6、,序,?,基因型、基因突变和多态性分析,?,疾病的诊断与治疗,遗传,病相关基因的定位,肿,瘤,诊,断,感染性疾病的,诊,断,耐,药,菌株和,药,敏,检测,聚合酶链反应,(polymerase chain reaction reaction,；,PCR),?,PCR,是八十年代中期问世的一种体外模拟体内,DNA,复制过程的技术，可在短时间内将待测特,异性,DNA,扩增百万倍以上，并具有简单、快速,、特异的特点，成为分子生物学发展史的又一,个里程碑。,?,PCR,不仅可检测各种,DNA,病毒的核酸，还可经过,逆转录，检测各种,RNA,病毒的核酸，因而在各,型肝炎病毒的检测中，敏感性远超过分子杂交,
7、，有着不可替代的作用。,PCR,的常见类型,?,常规,PCR,?,逆转录,PCR,（,RT,PCR,）,?,巢式,PCR,nested-PCR,?,原位,PCR,（,in-situ PCR,）,?,多重,PCR,?,?,?,?,非对称,PCR,?,?,免疫,PCR,?,?,定量,PCR,?,?,随机引物,PCR,?,?,简并引物,PCR,?,?,锚定,PCR,实时荧光定量,PCR,荧光检测技术,?,SYBR Green I,。是一种结合于所有,dsDNA,双螺旋小沟区域的,具有绿色激发波长的染料。,?,TaqMan,水解探针。由产荧光基团，荧光淬灭基团，与扩,增子有互补的特异核苷酸序列组成。,实时荧光定量,PCR,：水解探针法,退火,延伸,切割,聚合完成,?,该法也称,TaqMan,技术，,在,PCR,系统中，加入能和,靶核酸模板杂交的探针，,其,5,端带有荧光报告基团,，发射的荧光被,3,端带有,的荧光淬灭基团所吸收。,?,引物延伸时，由于聚合,酶具有的,5,3,核酸外切,酶作用，可把荧光报告基,团从探针上切下，因与淬,灭基团远离，发出的荧光,不被淬灭，随模板扩增和,游离荧光报告基团的增加,而增强，并和初始靶核酸,的量呈正相关。,TaqMan,法应用,?,起始模板的定量,?,基因型分析,?,目的基因定量,?,产物鉴定,?,单核苷酸多态性（,SNP,）分析,Think You,
