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1、第三节 动物的克隆,动物细胞的培养和克隆形成,1、动物细胞培养,（一）动物细胞、组织培养,将动物体内的一部分组织取出,分散成单个细胞,放在适宜的培养基培养,细胞得以生存并保持生命活动现象,生长、分裂乃至接触抑制和有规律的衰老、死亡等,一、动物细胞的培养和克隆形成,机械消化或胰酶消化,（1）定义,正常细胞,癌细胞,接触抑制,（2）动物细胞的培养过程,取动物胚胎或幼龄动物器官和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,2、为什么要用胰蛋白酶对取出的动物组织进行处理？,可以使动物组织细胞间的胶原纤维和细胞外的其他成分酶解，获得单个细胞,思考,1、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物
2、细胞培养材料？,因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强,3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养,原代培养,传代培养,从机体取出后立即进行的细胞、组织培养,原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长，增殖。,生长晕是指组织块接种进行细胞培养56天后，把培养瓶置于倒置相差显微镜下观察，可见到有细胞从组织块周边生长，呈放射状排列。,从动物胚胎或幼龄动物组织切片中取小片样品,转入特殊培养液原代培养,分装到多个卡氏瓶中传代培养,单个细胞悬浮液,细胞系,机械消化或胰酶消化（胰蛋白酶）,培养过程：,动物组织细胞间隙中含有一定量的
3、胶原纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,原代培养物,二氧化碳培养箱 通过在培养箱内模拟形成一个类似细胞或组织在生物体内的生长环境，如恒定的pH值（7.2-7.4）、稳定的温度（37C）、较高的相对湿度（95%）、稳定的CO2水平（5%），来对细胞或组织进行体外培养的一种装置。,如何界定原代培养和传代培养？为什么要传代培养？,细胞悬浮液,为什么？,1.离体动物细胞的生长特性：,（1）贴壁生长： 悬浮液中分散的细胞紧贴培养瓶内壁才能生长。（2）接触抑制： 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂。（3）正常的生命活动： 生长、分裂、有规律的衰老、死亡等现象
4、，但不分化。,2.传代培养的原因：,如果不进行传代培养，就会因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭，不能正常生长。,细胞系、细胞株,原代培养物,细胞系原代培养物在首次传代时就成为细胞系,连续细胞系,有限细胞系,细胞系,有关概念:,（2）连续细胞系:,（1）有限细胞系：,连续细胞株,有限细胞株,细胞株-,可连续传代的细胞,不能连续培养下去的细胞系,能连续培养下去的细胞系,大多数具有异倍体核型，有的是恶性细胞系，具有异体致瘤性，有的获得不死性（保留接触抑制，不致癌）,例：二倍体细胞,通过一定的选择或纯化方法，从原代培养或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞,具有恒定的染色体组型、同工酶类型、病毒敏感性和
5、生化特性。,（3）动物细胞培养的条件:,1.无菌无毒的环境2.营养3.温度和pH4.气体环境,植物组织培养和动物细胞培养的比较,细胞的全能性,细胞增殖,固体培养基,液体培养基,蔗糖 植物激素,葡萄糖 动物血清,植物体,细胞株、细胞系,快速繁殖、培育无病毒植株,获得细胞或细胞分泌蛋白,7.1951年，海拉细胞系的建成。,6.1950年，人工培养液“199”研制成功,1.1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。,2.1903年，皮肤及白细胞在腹水及血清中存活一个月，且观察到细胞分裂。,3.1907年，蛙胚神经管在蛙淋巴液中悬浮培养，成功看到神经末端的阿米巴运动。,4.1912年，鸡胚浸出液对鸡胚
6、心脏组织块进行原代培养和传代培养。,5.1943年，获得长期培养细胞系（可连续传代）和细胞克隆。,“组织培养”一词产生,真正的组织培养开始；创立了悬浮培养法,成功进行了传代培养；发明了卡氏瓶；,标志着组织培养工作进入全新阶段,（二）动物组织培养技术的发展,动物细胞培养：体外培养分散后的单个细胞，使其得以生存，并保持生命活动现象。像体内一样呈现一定的组织特性。,动物组织培养：体外培养动物组织，使其维持生活状态或生长特性。可以伴随组织分化，但最终成为细胞培养。,动物器官培养： 体外培养动物器官原基、部分或整个器官，使之得以保存、生长。保持器官的结构、功能及分化能力。,组织培养,第43页,（三）克隆
7、培养法,把一个单细胞从群体中分离出来单独培养，使之繁衍成一个新的细胞群体的技术,1.定义：,未经克隆的异质性细胞系,纯系：,克隆,经克隆以后的细胞的后裔细胞群，来源于一个共同的祖细胞。,2.产物:,遗传性状均一、表现的性状相似,3.细胞克隆的基本要求:,必须保证所建成的克隆来源于单个细胞,4.适合于克隆的细胞： 对环境有较大适应范围和具有较强独立生存能力的细胞,5.提高细胞克隆形成率的措施：,选择适宜的培养基添加血清 （胎牛血清） (能促进细胞的生长、增殖和贴附)以滋养细胞支持生长（经射线照射的小鼠成纤维细胞）激素刺激（胰岛素等）使用CO2培养箱，调节PH,群体细胞 单细胞无限细胞系、转化或肿
8、瘤细胞 原代细胞、有限细胞系,6.细胞克隆的主要用途： 从普通细胞系中分离出缺乏特殊基因的突变细胞系。 用于研究细胞的遗传规律和生理特性。,动物的细胞融合技术及其应用,动物细胞融合的方法有哪些？杂交瘤细胞的特点是什么？,第一次筛选,筛选的目的：获得杂交瘤细胞。,筛选的方法： 1、用选择性培养基来完成，即HAT培养基。,淋巴细胞： 不能生长，DNA的主要合成途径被A阻断。骨髓瘤细胞： 不能生长，HGPRT缺乏，DNA合成的旁路途经受阻。,杂交瘤细胞： 可长期生长繁殖。两者途径互补，完成DNA合成。,2、通过抗体检验，筛选出产生抗体的阳性细胞。,第二次筛选,筛选的目的： 筛选只针对某一种特定的抗原
9、决定簇产生抗体的杂交瘤细胞，即得到由一个细胞分裂而成的一个细胞群并且能产生所需抗体。,筛选的方法：（1）分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养。（2）检测每孔细胞是否产生所注射抗原部位专一的抗体。,选出产生特定抗体的阳性细胞再克隆。,动物的克隆繁殖,一、动物细胞全能性的表现程度,1、动物的受精卵，卵裂球含有2-8个细胞时，每个细胞具有全能性。,2、随着胚胎发育的继续，有的细胞只具有分化出各种组织细胞的潜能，这样的细胞叫多能干细胞。,3、有的细胞只能分化为一种细胞，叫单能干细胞。,受精卵,胚胎干细胞,多能干细胞,单能干细胞,体细胞,2.低等动物细胞：全能性一般容易体现。,1.高等动物细胞,3.
10、癌细胞：仍能逆转为正常细胞。,无论分化还是癌变，变化的都是表现型，基因组成的完整性可以保留。,一、动物细胞全能性的表现程度,为什么动物细胞很难表现出全能性？,二、动物难以克隆的根本原因,基因的选择性表达（差异表达），使得细胞中合成了专一的蛋白质，即动物细胞已经发生了分化。 分化的细胞，其基因组中的基因不同时进行活动。,动物基因组,一类基因：维持生存，各种细胞中都处于活动状态,一类基因：随着组织器官和发育阶段不同而选择性表达。,三、核移植和动物的克隆繁殖,1.核移植： 利用一个细胞的细胞核（供体核）,来取代另一细胞中的细胞核，形成一个重建的“合子”（重组细胞），使发育成一个新的个体。,胚胎细胞克
11、隆：使用的供体核来自胚胎,体细胞克隆：使用的供体核来自体细胞,1952年，罗伯特.布里格斯： 豹蛙 囊胚细胞核+去核的卵母细胞 发育成个体,1978年，童第周： 黑斑蛙成体红细胞核去核的卵细胞中发育成蝌蚪,2.动物克隆繁殖：,胚胎细胞核移植成功率远高于成体细胞核移植。,克隆羊培育过程,另一头绵羊的子宫,体细胞核移植技术实例2,体细胞克隆羊成功的分子细胞生物学机理：,1.核移植前对乳腺细胞的营养限制性培养（调节牛血清浓度）和电脉冲细胞融合技术(胚激活），有利于核的变化和细胞融合后基因表达分子开关启动。2.重组卵细胞最初分裂时，转录并未开始。3.重组卵细胞的供体核DNA丢失了来源于乳腺细胞的阻止核
12、基因表达的调节蛋白。4.开始第三次分裂时，原乳腺细胞的调节蛋白全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，核DNA被重新编排，胚细胞开始表达自己的基因。,体细胞克隆羊的培育成功，证明了什么？ 高度分化细胞经一定技术处理，也可回复到类似受精卵时期的功能。在胚胎和个体发育中，细胞质具有调控细胞核（包括异源的细胞核）发育的作用。 （核质互作）,3.动物克隆成功的条件：,（1）具有包含本物种完整基因组的细胞核的活细胞 如：乳腺上皮细胞；（2）能有效调控细胞核发育的细胞质物质 如：去核卵的细胞质；（3）完成胚胎发育的必要的环境条件 如：诱导重组细胞生长、分化的实验条件和怀胎母体的子宫环境,动物细胞工程技术的基础是：（）A动物细胞融合B胚胎移植C动物细胞培养D核移植,
