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1、动物疫病监测的采样技术邱荣斌西南科技大学生命科学与工程学院2014年11月18日,主要内容,动物疫病监测的概念及其意义检测样品存在的问题样品的种类高品质样品的特征如何得到高质量的样品,动物疫病监测,定义：调查动物群体中某种疫病或病原的存在情况。通过监测可以了解动物疫病的流行现状、危害程度、风险因子和发展趋势，早期识别疫病的爆发和流行。根据信息来源分为：问卷调查和实验室监测。实验室监测的关键:样品和检测技术。,实验室检测技术,病原检测：病原本身检测，病原特有蛋白检测，病原特有核酸检测，动物试验抗体检测：琼扩，试管凝集，平板凝集，血凝和血凝抑制，中和试验，各种ELISA等。在检测技术过关的情况下，
2、监测结果是否具有代表性，是否能够真实反映出疫病的真实情况都与监测样品的采集有重要关系。,一、样品存在的问题,样品的真实性（假样品，一个样品分开）样品的质量（溶血，腐败，反复冻融）采样单填写的信息不全（畜禽日龄，免疫情况等）组织样品采集的太大，不专业。样品编号不能追溯回去。,二、样品的种类,血液样品：血清，全血抗凝血，血浆组织样品：心肝脾肺肾脑，淋巴结，扁桃体粪便样品：新鲜，湿润的生殖道和精液样品皮肤样品：皮屑分泌液和渗出液样品：舌面或蹄部的水泡液,血液样品,血液：最常用的样品，可以做血清学试验的样品，也可以作为病原学试验的样品。全血（抗凝血）：抗凝剂有肝素，阿氏液，枸橼酸钠和4%EDTA，或者
3、用玻璃珠，脱纤维蛋白。血清：不加抗凝剂的血液，在室温静置24h（或371h），待血液完全凝固后，析出上清即为血清。血浆：抗凝血混匀后，静置，上清即为血浆。,检测样品的分类,细菌学检测样品：采集发病典型或刚死亡的整体动物送实验室为最好。无菌采集，冷藏，保存液中不加任何抗生素。 病毒学检测样品：病毒检测应在动物病初、体温升高期间采集。以组织脏器、血液、粪便等样品为主 。冷藏或冷冻，保存液中加抗生素。血清学检测样品：静脉采血3 ml左右，注射器内留一定空间，静置过程或已凝固的血液应低温冷冻，以免溶血。短时间内，可在4度左右保存；如时间较长应冻结保存，注意不能反复冻融.病理学检测样品：保证样品新鲜，应
4、选择病变最典型最明显的部位，且连同部分健康组织一并采集。 浸泡于酒精或福尔马林溶液中，冷藏保存和运输。,几种重要疫病的采样时机,禽流感、新城疫：发病初期采全血，泄殖腔咽喉棉拭子；后期采集新鲜粪便；剖剪后的气管，肺脏，肾脏等口蹄疫：全血，水泡皮，水泡液，O/P液及口腔分泌物和咽喉棉拭子猪瘟，猪伪狂犬，蓝耳病：全血，血清，组织病料：肺脏，脾脏，淋巴结，扁桃体，流产胎衣等，新鲜精液或冷冻精液猪流感：在发热期采集鼻咽棉拭子和肺组织病料。,三、高品质样品的特征,样品标记明确,样品新鲜,采样单填写规范,样本样品数量适当,四、如何得到高质量的样品,1、采样前的准备-器具,采样工具：一次性注射器，解剖刀，剪刀
5、，镊子，酒精灯，酒精棉，棉签，保定动物专用工具样品存放用具：塑料离心管（1.5，2，5ml），自封口样品袋，试管架，塑料样品盒，胶布，封口膜，冰袋。防护用具：一次性手套，鞋套，口罩，隔离衣等。记录用具：不干胶标签、圆珠笔、油性记号笔、采样单、记录本等,2、采样前准备采样技术,血液样品：牛、马、羊从颈静脉或尾静脉采血；猪从前腔静脉采血，用量少时也可从耳静脉抽取；家禽从翅静脉抽取。棉拭子样品：泄殖腔，咽喉，鼻腔水泡皮及水泡液：O/P液：保定，左手拉出舌头或从嘴的一侧按住舌头，右手缓慢放入探杯。组织样品：解剖，洁净取样。,血液样品的分离方法,抗凝血：采血前在试管或注射器内按比例加抗凝剂，运输时必须减
6、少震荡以免溶血。非抗凝血：分离血清血清析出好的因素：容器：玻璃试管优于塑料离心管；斜面：与空气接触面要大。温度：最佳温度是体温；时间：室温静置最短2小时；离心：转速要低，2000转。胶冻状血清的成因：采血前刚刚喂食（没有空腹）；凝血时间不够；脂肪血（营养过剩）,粪便、棉拭子和O/P液样品的采集,泄殖腔拭子的采集：将棉拭子插入泄殖腔约1.52cm,旋转后沾上粪便。 咽喉拭子、鼻腔拭子的采集：将灭菌的干棉拭子插入口腔至咽的后部或鼻腔，轻轻擦拭并慢慢旋转将拭子拔出，将棉拭子放入缓冲液内。 O/P液是从动物食道/咽喉刮取的黏膜样品，用特制的食道探环刮取黏膜，放入样品保存液中。,水泡液及水泡皮的采集,用
7、75%酒精消毒水泡表皮，用灭菌生理盐水擦去酒精，用注射器穿刺吸取水泡液，置于含抗生素的PBS缓冲液中；然后用剪刀将水泡皮剪下，放入含抗生素的PBS缓冲液中。,3、采样的准确性和时效性,代表性：应该考虑到整个监测区域的地理分布，选取有代表性的点。如动物品种分布、日龄、饲养密度、地势特点、交通特点、动物迁徙习性等因素。如禽流感采样时，疫区交接处，野鸟迁徙途径，水禽家禽混合饲养处等。 时效性：如抗体监测，免疫后14天左右才可以采集；监测病原时，注意排毒时间和病原的易嗜细胞和组织，在监测时要根据不同时期，采集不同部位的组织进行检测。如口蹄疫病毒首先是在咽喉部和肺上皮细胞扩增，然后进入血液，通过分泌物、
8、水泡排毒。,样本样品的数量,样本：总体中的一部分代表；样品：检测的原始材料。概率抽样（随机抽样）：是按照随机原则进行抽样，不加主观因素，组成总体的每个单位都有被抽中的概率（非零概率）比例抽样：按养殖规模成比例抽样。多阶段抽样：全市分区，每个区随机选县，每个县选乡镇，每个乡镇选养殖场。样本量，符合统计学要求，决定因素：疫病在群体中的发生率，可信水平，检测方法 的敏感性和特异性。样品的量要足够检测使用。,4.1样品的包装和编号,单个样品的包装动物血清、全血、棉拭子、水泡液，加有PBS的粪便等液体样品用用1.5ml，2ml，5ml带盖的塑料离心管；组织病料等固体样品用自封口样品袋，或放入1.5ml及
9、2ml塑料离心管；每次送样的同一种样品进行编号，每个样品都要有唯一编号，标识清楚，不易丢失。每组样品的包装以镇或每个采样点为单位分组，每组一个大包装，用自封口样品袋包装，并贴有标签，注明样品名、样品编号、采样日期等。,4.2样品的记录,单个样品的小塑料离心管外用油性记号笔标记每组样品自封袋外用钢笔填写样品标签和封条编号与采样单一致，具有唯一性和可追溯性。填写采样单：被采样畜主的联系方式和采样人的联系方式；被采样动物的健康状况和免疫状况；被采样动物的联系方式（畜种，日龄，标识号等）；样品运输方式；日期，签名（采样人，畜主）每类样品要求填写一份采样单。,5、样品追溯,样品编号和填写采样单目的就是对
10、检测结果的追溯。动物防疫法规定动物免疫抗体监测、动物疫病病原监测、动物疫病应急流行病学调查等均实行可追溯制度。追溯内容：家禽来源、饲养周期、防疫情况、免疫程序、疫苗及兽药的使用情况。抗体监测要求追溯到每栋，每舍。病原学监测必须追溯到每只，每头。,6.1样品的保存,血清：4-8冷藏，不超过2周；抗凝血： 4-8冷藏，不超过1周；病毒检验材料：短时间可冷藏，否则须-20 或-70 以下保存，无条件的可置灭菌50%甘油-PBS液中冷藏，不宜反复冻融。细菌检验病料：冷藏，不宜冷冻，可置灭菌的30%甘油-PBS液/盐水中冷藏。 所有冻存样品忌反复冻融,6.2样品的运输,关键是：容器（密闭）温度（低温）时
11、间（越快越好）容器：密封容器，防止渗漏，造成环境污染或疫情扩散。温度：样品应在低温下保存和运输（放置冰块）。拭子样品和组织样品应作暂时的冷藏或冷冻处理，然后运送。血清样品，若 24h内运达实验室，冷藏运输；若超过 24h，要先冷冻后，再冷藏运输，途中不能超过 48h。时间：若能在4h内送到实验室，可用冰袋冷藏运输。如果超过4h，应置于-30 作冷冻处理，再在保温箱内加冰袋运输，在24h内送到。若 24h不能送到实验室，则运输过程中环境温度应保持在-20 以下（干冰）。,样品运输保存液,2550甘油生理盐水含双抗及20%甘油的PBS缓冲液（病毒检测采样液）氯化钠：8g；磷酸二氢钾0.2g；磷酸氢
12、二钠2.9g；氯化钾0.2g，将上述试剂按次序加入定量容器中，用适量蒸馏水溶解后加入200ml甘油，定容至1000ml,PH调至7.4，112Kpa20min,冷却后4保存，使用前加入双抗（青霉素2000IU/ml,链霉素2mg/ml。,五、采样时注意事项,注意人畜共患病：做好自身防护，不直接接触动物样品。注意人为的传播疫病：采样工具和防护用品，随身带走，统一消毒。采样动物的健康状况（饮食，免疫，用药等）采集的病料应该包装好，防止污染环境，防止无意的传播疾病，做好环境消毒和病害肉的处理。对于突发事件中急性死亡的动物，如怀疑是炭疽，不能随意解剖，可以采血，或局部解剖做病理切片。,谢谢大家！,谢谢大家！,
