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1、第七章 抗体类药物,一、概述二、抗体分子的结构三、抗体类药物的分类四、治疗性单抗研制进展,3,抗体的概念：,定义一：抗原诱导由淋巴细胞合成和分泌的，具有特殊氨基酸序列和结构的免疫球蛋白分子(lg)。定义二：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 具有抗体活性及化学结构与抗体相似的球蛋白，统称为免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）。,一、概述,人体中主要的抗体及性质,5,抗原,抗体由抗原诱导产生，抗原是抗体药物的靶分子。抗体所针对的抗原可包括：半抗原。蛋白如糖蛋白或脂蛋白。多糖如脂多糖。人体疾病相关基因及其编码的蛋白。各种病原体如病毒、支原体、细菌、原虫、寄生虫。,（一）、
2、 抗体分子结构,轻链（Light chain）上有一个轻链易变区（Variable region of light chain，VL）及一个轻链恒定区（Constant region of light chain ，CL）。重链（Heavy chain）有一个重链易变区（ Variable region of heavy chain，VH）及3-4个重链恒定区（CH1-CH4）。,9,抗体多样性,体细胞突变，B细胞分化过程中点突变可反复进行，使分化中的B细胞受抗原压力选择体细胞内重组基因转换核苷酸掺入,抗体多样性-抗体编码基因较多,轻链L编码区由V、J和C区组成，其中V、J组成可变区,抗体多样
3、性,重链H编码区由V、D、J和C区组成，其中V、D、J组成可变区,12,抗体多样性,Lg分子氨基端L链1/2与H链的1/4区段的氨基端组成及排列顺序多变，称为可变区（V区）。Lg分子氨基端L链1/2与H链的3/4区段的氨基端组成及排列比较恒定，称为恒定区（C区）。可变区中互补决定区CDR 具有很大的变异性，而恒定区中FR 保守。,13,抗体独特性,编码重链和轻链的基因重排后，进行表达生成细胞表面受体并能与抗原发生作用。只有这些B cell表达的表面Lg与一个外源抗原结合后才会引发进一步的反应。在这些识别过程中将自身抗原识别掉排除。识别外源抗原的B cell被诱导增殖并分泌抗体，在此过程中，可变
4、的结构域CDR的特定部位被诱导发生随机突变，B cell在反向于那些与抗原有高亲和力的突变抗体的分泌。这个过程非常高效，使免疫系统具有产生对抗任何外来分子抗体的能力。可变区这种独特的装配方式叫做抗体的独特性,14,（二）、抗体的主要作用,结合抗原中和毒素促进吞噬功能,1. 特异性地结合抗原(Specific combine Ag)是由V区（尤其是V区中的超变区）的空间构型决定的，是可逆的，并受到pH、温度和电解质浓度的影响。 aa极大变化的超变区（Hypervariable region，HV）或互补决定区（Complementarity determining region，CDR），CDR
5、1CDR3 （各516aa）：可特异性结合Ag；框架区（Framework region，FR）：为片层结构，aa序列相对稳定，不与Ag直接结合。,攻击病毒,凝集细菌,2. 活化补体(Activate complement)IgM 、IgG1、 IgG2和IgG3 可通过经典途径活化补体。凝聚的IgA、 IgG4和IgE等可通过替代途径活化补体。,3. 结合Fc受体 (Combined Fc receptor) 不同细胞表面具有不同Ig的Fc受体，分别用FcR、 FcR等表示。当抗体与相应抗原结合后，由于构型的改变，其Fc段可与具有相应受体的细胞结合，发挥不同的生物学作用：（1）介导型变态反应
6、 IgE与嗜碱性粒细胞、肥大细胞表面IgE高亲和力受体FcRI结合，发生脱颗粒，引起型变态反应。,（2）调理吞噬作用 抗体在抗原颗粒与吞噬细胞之间“搭桥”，加强了吞噬细胞的吞噬作用； 抗体与相应颗粒性抗原接合后，改变抗原表面电荷，降低吞噬细胞与抗原之间的静电斥力； 抗体可中和某些细菌表面的抗吞噬物质； 吞噬细胞FcR结合抗原抗体复合物后，吞噬细胞可被活化。,抗体介导的调理作用,（3）发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC作用） 当IgG抗体与带有相应抗原靶细胞结合后，可与嗜中性粒C、单核C、巨嗜C、NKC等效应C结合，发挥ADCC作用。,NK细胞介导的ADCC作用,4. 通过胎盘(Thr
7、ough placenta) 在人类，IgG是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的Ig，是一种重要的自然被动免疫，对于新生儿抗感染有重要作用。,抗体的功能,（三）、抗体分子的治疗作用 各种抗体被广泛地应用于疾病的的诊断、预防及治疗：1、在体外诊断上，用于检测各种抗原，包括感染性病原体抗原、血清肿瘤可溶性抗原、细胞表面抗原、受体、激素、神经递质、细胞因子等。 2、在肿瘤检测方面，同位素标记的单克隆抗体可与肿瘤组织表面的抗原结合，起到免疫扫描、免疫成像的作用，优于超声波和核磁共振。 3、在预防方面，抗体主要可用于感染性疾病的预防，如流感、乙肝等。,1. 抗体的治疗机制（1）中和作用(Neutriliz
8、ation) 用于感染性疾病，使病原体或其产生的毒素丧失致病力。 （2）示踪或导向作用（Tracer or targeted effect） 使与其相连的功能性分子特异性地激活或封闭、破坏靶细胞或靶分子。,（3）竞争性抑制作用/拮抗作用(Competitive inhibition) 与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶分子作用产生毒性损害。（4）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（Ab dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（Complementarity dependent cytolysis, CDC）。（5）通过
9、内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性及广泛性。,2. 抗体的治疗应用 随着抗体制备技术的进步，治疗性抗体已逐渐从实验室走向临床，并在多种疾病的治疗方面展示了光辉的前景。（1）抗肿瘤作用(Anti-tumor) 由于多克隆抗体本身的局限性，所以直到单克隆抗体出现，抗体用于抗肿瘤治疗才真正得以实现，自从1978年成功制备第一株抗黑色素瘤单抗以来（Steplewski 1979），出现了抗胃肠癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、胰腺癌、神经胶质瘤等的单克隆抗体，并于1980年首次在美国开展了单克隆抗体肿瘤治疗的临床试验。,1983年Miller等报道了一例经单克隆抗体治疗的淋巴瘤患者，在放疗、化疗及干
10、扰素治疗后，使用单克隆抗体治疗存活超过了4年。 单克隆抗体杀伤肿瘤细胞的机制可能是：抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（CDC）。,单克隆抗体与药物、毒素或放射性物质偶联，成为一种全新的“生物导弹”，可用于导向治疗。单抗给予T细胞所必需的重要表面信号分子交联的刺激信号和生长信号，体外诱导肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（tumor specific cytolytic T lymphocytes ，TS-CTLs）可用于特异性、被动性的免疫治疗。,（2）抗感染作用(Anti-infection) 应用疫苗、免疫球蛋白，预防和治疗感染性疾病。（对不能获得相应疫苗的病毒感
11、染，AIDS及一些危重情况，如内毒素休克等则无效）被动抗体疗法主要机制是中和病毒，并已证明抗体在体外及体内中和病毒的效应不依赖于Fc介导的功能和双价的存在，但可能受抗体亲和力影响。,（3）抗器官移植排斥反应(Anti-repelling of organ transplant)抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途径和分子机制中的某一环节，产生免疫抑制效应，预防排斥反应发生。Tc共有的分化抗原CD3（Cluster of differentiation ）分子及IL-2R 对T细胞的活化、增殖起重要作用，因此抗CD3及抗IL-2R工程抗体的研究较为多见。,（4）抗血栓形成 封闭血小板糖蛋白b/
12、a 整合素受体，是血栓性疾病治疗上的突破（Tubeliverst 1999）。近年来许多关于抗GPb/a单抗C7E3的研究表明，C7E3能对90%以上的受体产生阻断效应，减少了35%高危的经皮腔冠脉介入治疗（PTCA）后缺血性并发症及27% 6个月内的临床再狭窄的发生，并证明C7E3能预防动脉但不能预防静脉的血栓再形成。,（5）解毒(Detoxicating)对药物或动物毒素中毒患者，免疫治疗是应用抗该药物或毒素特异性抗体或其片段。抗体与毒素形成复合物，改变了毒素的药物动力学，使毒素与受体解离，从其结合部位呈梯度流出，进入血循环中。这种方法对强心苷中毒有明确疗效。基因工程抗体对百草枯及蛇毒中毒
13、也有一定作用。,（6）构建抗独特型抗体疫苗(Constuction of anti-idiotype vaccine)抗独特型抗体在结构和功能上均能模拟抗原（内影像作用）而发挥效应。据此构建的独特型疫苗模拟肿瘤相关蛋白抗原，能诱导抗肿瘤免疫反应。,（7）在自身免疫性疾病及变态反应性疾病中的应用（apply to immunity disease and abnormality reaction）自身免疫病多与单或寡克隆抗体的异常增多有关。利用基因工程技术制备针对这些异常抗体独特型的抗抗体或与自身抗体结合并抑制其作用；或制备能模拟抗原的内影像抗体用于中和体内的自身抗体。针对不同发病机制，治疗方法
14、趋于多样化。,许多变态反应与IgE有关。Fc片段可与变应原特异性IgE竞争结合嗜碱性粒细胞，封闭变应原介导的组胺释放。还可生产出与患者IgE竞争结合变应原的Fab样分子。,三、抗体类药物分类,第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体第三代：基因工程抗体第四代：单域抗体,抗体技术的发展经历了四个阶段,指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。,1、多克隆抗体(polyclonal antibody; pcAb),1 2 3Ag A,x y zAg B,1 2 0Ag A,cAb的制备,多价抗原,致敏B细胞,传统抗血清,所有抗体混合,对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（
15、a）和免疫后10天 （b）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的g 球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失（c）。,a1,a2,b,g,白蛋白,球蛋白,（c）,（a）,（b）,实际意义： （1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 胎盘球蛋白 抗病毒感染等， 副作用： 超敏反应。 （2）临床诊断， 如：肥达氏反应 - 伤寒、副伤寒， 缺点：特异性差。,2、单克隆抗体（mAb）,可生产有用抗体的 淋巴细胞 若与 癌细胞融合，则形成稳定而可培养的细胞株。,癌细胞可培养生长,浆细胞B cell可分泌抗体,融合瘤Hybr
16、idoma,细胞融合,两组染色体混在一起,也可以培养生长产生专一性抗体,一个B cell只产生一种抗体, 一个 B细胞只能生产一种抗体，针对某一 抗原决定簇。, 若有许多抗原决定簇，则需许多株 B细胞分别生产许多抗体。,B,B,B,Y,Y,Y,Y,抗 原,B,Y,B,亲和力成熟,1,1,2,3,4,抗原决定簇,单抗制备的流程图,49,单克隆抗体的概念,杂交细胞：在诱导物的作用下同一细胞或不同细胞间的融合，融合的细胞具有双亲本细胞的染色体和全部或部分特性。杂交瘤细胞：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后产生的杂交细胞。单克隆抗体：具有分泌抗体能力的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞经无性繁殖形成
17、的细胞系分泌产生的活性、亲和力均相同的抗体。,50,单克隆抗体的特点,多克隆抗体的不足：假阳性、制备困难、产量低。单抗中抗体分子在Aa序列和空间构型上均相同。单抗具有高度的特异性。产生单抗的细胞系可长期传代并保存，可持续生产同一性质的抗体。,实际意义： （1）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗， 如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 McAb抗癌药物(毒素或放射核素偶联),多克隆抗体与单克隆抗体的比较,3、基因工程抗体,通过基因重组改良抗体性能通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体,54,单克隆抗体的不足,鼠源性单克隆抗体，应用于人体内可产
18、生人抗鼠抗体（human antimouse antibody, HAMA)人体的排斥反应人体内半衰期只有5-6小时到达靶组织的药量仅有1完整的抗体分子的相对分子量较大，穿透力不强，难以到达病灶的核心部位,1 小分子抗体,3 鼠单抗人源化,基因工程改造的抗体,2,(1) 小分子抗体,1,2,3,免疫球蛋白基因载体的构建,H链表达载体,L链表达载体,共转染细胞,Pr VH CH1 Pr VL CL,Fab 抗体分子的制备,I Fab antibody molecule,抗体分泌细胞,VH,VL,CL,-S-S-,CH1,Fab 抗体分子的制备,II Fv antibody molecule,分别
19、构建载体,L链表达载体,H链表达载体,共转染细胞,Pr VH Pr VL,Fv 二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备,ds-Fv,抗体分泌细胞,VH,VL,-S-S-,Fv小分子抗体的制备,disulfide-stabilized Fv,ds-Fv,VH VL,接头DNA (Gly4Ser)3,VH引物,PCR,VH 接头DNA,酶切、克隆,ScFv (single chain Fv,scFv )的构建,变性、复性,VL引物,Sc-Fv,VL,双特异性抗体,抗原A,抗原B,-S-S-,Fab,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,V
20、H,VL,Fv,VH,VL,为了提高抗体药物特别是治疗肿瘤抗体药物的效应功能，加强其对肿瘤细胞的杀伤作用，人们常用效应分子或称“弹头”物质通过化学方法与抗体连接，制成免疫偶联物（ immunoconjugates),这类抗体靶向治疗药物以前也称为“生物导弹”，它利用抗体的特异性作为导向甘休，利用“弹头”杀伤肿瘤靶细胞。“弹头”物质主要有3类，即放射性核素、药物和毒素“弹头”物质与抗体连接后分别构成放射免疫偶联物（ radioimmunoconjugae)、化学免疫偶联物(chemoimmunoconjugate)与免疫毒素(immunotoxin)。通过基因工程方法可以制成融合蛋白，融合蛋白的
21、抗体部分一般为单链抗体scFV,“弹头”部分一般为毒素片段、细胞因子或肽类药物。,（2）抗体偶联物,与单抗偶联的常用“弹头”药物,毒素植物 蓖麻毒素，相思豆毒素，saporin，gelonin，modecin等微生物 绿脓杆菌外毒素，白喉毒素 药物抗代谢类 氨基蝶呤，MTX，Ara-C，5-FU，5-氟脱氧尿苷等蒽环类 阿霉素，柔红霉素，去甲氧柔红霉素，吗啉阿霉素等烷基化类 苯丙氨酸氮芥，苯丁酸氮芥，丝裂霉素C，顺铂等抗有丝分裂 长春花碱，秋水仙碱，鬼臼毒素等抗生素 Calicheamicin，博莱霉素，平阳霉素，力达霉素 核素 131I、125I、90Y 、67Cu 、111In 、99mT
22、c等,抗原结合部位与生物活性蛋白结合免疫导向免疫桥连嵌合受体含Fc段的抗体融合蛋白免疫黏附素 Fc的作用：检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能,（3）Fc融合蛋白,Fc,protein,SPA,thrombin,Fc的作用：检测、纯化、,TAT AAA TAA GCT TTAATA TTT ATT CGA AAT,G-CSF,Fc,Fusion Protein,HindIII,HindIII,G-CSF,TAT AAA TA A GCT TTAATA TTT ATT CGA AAT,Mean bean nuclease,TAT AAA TA TTAATA TTT AT AAT,Sto
23、p codon TAA TAG TGA,TAA,第二节 抗体制备,指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。,一、多克隆抗体(polyclonal antibody; pcAb),1 2 3Ag A,x y zAg B,1 2 0Ag A,cAb的制备,多价抗原,致敏B细胞,传统抗血清,所有抗体混合,对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（a）和免疫后10天 （b）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的g 球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的 球蛋白条带缺失（c）。,a1,a2,b,g,白蛋白,球蛋白,（c）,（a）,（b
24、）,实际意义： （1）预防、治疗感染性疾病， 如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风， 胎盘球蛋白 抗病毒感染等， 副作用： 超敏反应。 （2）临床诊断， 如：肥达氏反应 - 伤寒、副伤寒， 缺点：特异性差。,二、单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）,单抗制备的流程图,76,制备针对特异抗原的单克隆抗体,制备抗原凡具有抗原性的物质均可免疫时抗原纯度可不高纯度高的抗原利于以后筛选,骨髓瘤细胞常用的骨髓瘤细胞系小鼠的BALB/c细胞系大鼠的Lou细胞系免疫动物应与骨髓瘤细胞供体相一致,一般选40-50%的PEG 进行诱导。细胞融合后培养液中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤、脾、瘤等细胞
25、。常用的选择性培养基为HAT培养基。,将经融合的混合细胞用HAT培养液悬浮稀释。一般在含有饲养细胞的96孔板中进行。在融合后7d用HAT选择培养基培养，7-14d用HT培养基培养，14d后用完全培养基培养。,选择培养后，只有杂交瘤细胞才能生存。但不是所有的杂交瘤细胞均能产生所需的抗体。产生特定抗原的抗体的B细胞只占所有脾细胞的5左右。用抗原对所有小孔的培养上清进行抗体检测，筛出能产生目的抗体的杂交瘤细胞。,将能产生目的抗体的培养小孔中的杂交瘤细胞进行稀释。可用有限稀释法和软琼脂法。有效稀释时，将细胞稀释液分加到96孔板中，使每个小孔在理论上只有一个细胞。软琼脂法。,培养后，取上清进行抗体检测，
26、获得能产生目的抗体的杂交瘤细胞系。大量生产目的单克隆抗体。体外培养法，10 g/ml。动物体内诱生法， 5-20 mg/ml。,骨髓瘤细胞 - 无限增殖； 免疫B细胞 - 合成、分泌特异性抗体。 杂交瘤技术 - HAT培养基：次黄嘌(H), 氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。,83,单克隆抗体的概念,杂交细胞：在诱导物的作用下同一细胞或不同细胞间的融合，融合的细胞具有双亲本细胞的染色体和全部或部分特性。杂交瘤细胞：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合后产生的杂交细胞。单克隆抗体：具有分泌抗体能力的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞经无性繁殖形成的细胞系分泌产生的活性、亲和力均相同的抗体。,84
27、,单克隆抗体的特点,多克隆抗体的不足：假阳性、制备困难、产量低。单抗中抗体分子在Aa序列和空间构型上均相同。单抗具有高度的特异性。产生单抗的细胞系可长期传代并保存，可持续生产同一性质的抗体。,实际意义： （1）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗， 如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 - McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。,多克隆抗体与单克隆抗体的比较,第三节 基因工程抗体（genetic engineering antibody）,一 抗体分子结构,免疫球蛋白分的基本结构,免疫球蛋白的水解片段,免疫球蛋白的功能区,compl
28、imentarity determining region, CDR,hypervarible region (HVR)(complimentarity determining region, CDR) :formation of the Ag binding site,purple : HV CDR ( in both the ribbon and ball and stick views) green : antigen HV sequences contact the antigen.,antibody,antigen,antigen-antibody complex:,epitope,
29、Representation of the disassociation of an antibody (top) and antigen (botton) molecule.,CDR,Epitope,1 小分子抗体,3 鼠单抗人源化,2,基因工程抗体分类,98,(1) 小分子抗体,1,2,3,免疫球蛋白基因载体的构建,H链表达载体,L链表达载体,共转染细胞,Pr VH CH1 Pr VL CL,Fab 抗体分子的制备,I Fab antibody molecule,抗体分泌细胞,VH,VL,CL,-S-S-,CH1,Fab 抗体分子的制备,II Fv antibody molecule,分别
30、构建载体,L链表达载体,H链表达载体,共转染细胞,Pr VH Pr VL,Fv 二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备,(1) ds-Fv,抗体分泌细胞,VH,VL,-S-S-,Fv小分子抗体的制备,disulfide-stabilized Fv,ds-Fv,VH VL,接头DNA (Gly4Ser)3,VH引物,PCR,VH 接头DNA,酶切、克隆,ScFv (single chain Fv,scFv )的构建,变性、复性,VL引物,(2) Sc-Fv,VL,III Diabody structure,双特异性抗体,抗原A,抗原B,-
31、S-S-,Fab,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,VH,VL,Fv,VH,VL,CTL,CD3,TUMORCELL,-S-S-,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,抗原A,抗原B,(2) 抗体融合蛋白,抗原结合部位与生物活性蛋白结合免疫导向免疫桥连嵌合受体含Fc段的抗体融合蛋白免疫黏附素 Fc的作用：检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能,Fc,protein,SPA,thrombin,Fc的作用：检测、纯化、,G-CSF,Fc,Fusion Protein,DNA ligation,expression,Fc的作用：延长血清中半寿期,(3) 鼠单抗人源化,恒定区人源化人-
32、鼠嵌合抗体可变区人源化人改型抗体用抗体库技术进行人源化,鼠单抗人源化,嵌合抗体（chimeric antibody）:在基因水平上将小鼠的Ig可变区与人的Ig恒定区嵌合在一起，所产生的抗体含有70-80% 的人Ig分子的序列，在很大程度上减少了单克隆抗体的免疫原性，但这种抗体尚存20-30%的鼠源成分，在实际应用过程中仍可刺激机体产生较强的抗独特型反应。,人-鼠嵌合抗体,嵌合抗体技术,人-鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。研究人员设想，用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。因为Fc区的主
33、要功能是激活机体免疫反应，也是产生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗体Fc区的DNA片段替换鼠源性的Fc段DNA。,Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL,免疫球蛋白基因载体的构建,H链嵌合载体,L 链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略,MabThera for the treatment of non-Hodgkin-lymphomas,Malignant B-cells are destroyed after docking of MabThera,鼠单克隆抗体V区的人源化,人改型抗体（CDR移植）,人源化抗体（humanized antibody）又
34、称CDR移植抗体（CDR grafting antibody）,改型抗体技术,嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而仍有一定的免疫原性。为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为CDR移植抗体（CDR grafted antibody） 。这种抗体在人体内免疫性大为降低,抗体库技术,抗体库在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire) 通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因,三 基因工程方法研制新的单抗,抗体库技术产生的三项
35、技术基础, RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达 噬菌体展示技术（phage display),噬菌体表面展示技术(Phage display technology),噬菌体表面展示技术即用PCR技术从生物体内扩增出整套编码人抗体的基因序列，克隆到噬菌体载体上，并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面，从而可以方便地利用抗原一抗体特异性结合进行筛选、扩增。,噬菌体抗体库技术,将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录成cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；然后用限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白基因连接
36、成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；再用ELISA或免疫亲和层析法即可筛选出特异性抗体。,用PCR扩增人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因克隆到噬菌体载体并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面用抗原抗体反应筛选出表达所需要抗体的克隆并扩增。使抗体基因以分泌的方式表达，获得可溶性的抗体片段。抗体库： 组合抗体文库：在建库过程中如果将VH和VL随机组合 人天然抗体库：抗体mRNA来源于未经免疫的正常人,（一）基本原理和程序,接头DNA,VH VL,噬菌体表面呈现的小分子抗体,基因III或基因VIII,外壳蛋白,VH,VL,噬菌
37、体抗体图示,抗体库的构建,抗体库的富集筛选,模拟天然全套抗体库抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA通用引物具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性避开了人工免疫和杂交瘤技术抗体库的大容量抗体库极高的筛选效率可获得高亲和力的人源化抗体VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程所用的抗体基因又来自人体,（二）噬菌体抗体库技术的特点,抗体库技术的应用, 人源抗体的制备 抗体性能的改良 不经免疫制备抗体,核糖体展示技术(Ribosome display teclmology),该技术将基因型和表型联
38、系在一起，编码蛋白的DNA在体外进行转录与翻译，核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停留在mRNA的3末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，然后进行筛选，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA进行RT-PCR，PCR产物进入下一轮循环，多次循环后可使目标蛋白及其编码的基因序列得到富集和分离。,转基因技术,全人抗体还可以通过小鼠的基因工程免疫方法获得。 产生一免疫反应的基因工程敲 除鼠，然后用杂交瘤技术使小鼠的脾细胞或淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。通过灭活内源 性的小鼠抗体基因，然后引进人源抗体基因片段，当对人源抗体免疫的时候就可以在
39、小 鼠体内产生全人抗体分子。,另一种方法是将人抗体基因微位点转入小鼠体内细胞，转染 色体小鼠的免疫抗原基因环境和人类非常相似。 还有一种不同的方法是向免疫供体或混 合性严重免疫缺陷的小鼠注入人源淋巴细胞， 通过抗原免疫使小鼠脾细胞融合骨髓瘤细 胞,四、人源化抗体的表达体系,1 大肠杆菌表达体系 2 酵母表达体系 3 昆虫杆状病毒表达系统 4 哺乳动物细胞系统 5 植物细胞表达系统 6 转基因动物表达系统,由于完整的抗体分子是由重链和轻链通过二硫键组装成的有生物功能的免疫球蛋白，而大肠杆菌体系缺少转录及翻译后加工机制，表达的蛋白质不能形成适当的折叠、进行糖基化修饰或正确形成二硫键等，所以不适于完
40、整抗体分子的表达。因而更多的是用来高效表达Fv、Fab及ScFv等功能片段。,1 大肠杆菌表达体系,2 酵母表达体系,主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母表达系统使用最广泛。巴斯德毕赤酵母系统作为甲醇酵母系统之一，使用得最多，也最广泛。,3 昆虫杆状病毒表达系统,昆虫杆状病毒表达系统是一种优良的真核基因细胞表达系统。由于昆虫细胞来源广，比较经济，而且具有正确完成蛋白质翻译后加工和糖基化修饰等诸多优越性，已被广泛应于外源基因的表达。但该系统也存在不足之处，即病毒感染会引起细胞的死亡，因此大批量生产有一定的困难。,4 哺乳动物细胞系统,该表达系统可以正确地进行
41、翻译后修饰，遗传稳定，成为嵌合抗体最合适的宿主。其中常用的宿主细胞有3种：非洲绿猴肾(COS)细胞；骨髓瘤细胞如Sp2O；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。目前应用这些细胞已成功表达了多种人源化单抗。,5 植物细胞表达系统,植物细胞中有着与动物细胞相似的蛋白质合成、分泌、折叠及翻译后修饰途径，只是在蛋白质糖基化上与动物细胞略有差异。抗体能在植物的叶子和果实中表达，而不丢失其结合的特异性与亲和力。1999年，Vaquero等报道了采用两个独立的植物表达载体在烟叶中瞬时表达人一鼠嵌合抗体。,6 转基因动物表达系统,利用转基因动物制药具有生产成本低、投资周期短、表达量高、与天然产物完全一致、分离纯化容易的优势，尤其适合于一些使用量大、结构复杂的血液因子，如人血红蛋白、人血清白蛋白、蛋白C、纤维蛋白原和抗体等。,五、人源化抗体展望,近年来，无论是学术界还是商业团体，都对治疗性抗体的研究表现出越来越大的兴趣。人源化抗体和全人源化抗体的出现，为治疗性抗体的广泛应用带来了新的希望。但人源化抗体是否可以解决鼠抗体临床应用中出现的所有问题，还有待大量临床试验的检验。,目前，抗体人源化方法还在不断发展和完善，目标是提高抗体亲和力、降低抗体异原性，同时兼顾抗体的免疫学活化作用。另外，针对不同的异源抗体，选择合适的人源化途径来构建更适合于临床应用的人源化抗体，将为新药的开发和一些顽固疾病的治疗开辟新的路径。,
