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1、厌 氧 氨 氧 化Anammox,主要内容,Anammox 研究进展,水体富营养化,水体富营养化,2011中国环境状况公报,在监测的26个湖泊（水库）中，富营养化状态的湖泊（水库）占53.8%，其中，轻度富营养状态和中度富营养状态的湖泊（水库）比例分别为46.1%和7.7%。,水体富营养化,水体富营养化,水体氮素污染,传统生物脱氮工艺,满足,厌氧氨氧化工艺,低碳氮比、高氨氮有机废水。,Anammox 定义,Anammox：在缺氧条件下通过微生物的作用，以亚硝酸氮为电子受体，氨氮为电子供体，将亚硝酸氮和氨氮同时转化为N2的过程。,Anammox 发展简史,1977年， Broda根据自由能的变化
2、，预言自然界中存在着能催化亚硝酸和硝酸氧化氨的细菌，认为它们是隐藏于自然界的自养型细菌。1995年，Mulder和van de Graaf等用流化床反应器研究生物反硝化时，发现了氨氮的厌氧生物氧化现象，从而证实了Broda的预言。2002年，世界第一座Anammox工业化生产反应器在荷兰鹿特丹污水处理厂投入运行。,Baltimore 内港、日本海Chesapeake 海湾波罗地海的芬兰湾安哥拉的Benguela上升流英国的泰晤士河口丹麦Mellerup 河口南海等,2002,2003,2004,2004-2013,海洋中,1 厌氧盆地黑海2 哥斯达黎加Golfo Dulce 海湾,北极圈极地海
3、冰,波罗的海过渡区大陆架沉积物,Anammox 分布,Anammox 分布,除了海洋、河口、海湾外，在陆地生态系统中也存在Anammox，湿地、农田土壤、冻土层、蓄水层等土壤干湿界面也有探测到Anammox菌。,Anammox 生物脱氮研究,荷兰Delft大学生物技术系：Anammox 研究的发源地；目前主要研究Anammox脱氮工艺及其应用。荷兰的Paques 公司首家将Anammox 工艺工程化应用的公司。世界10座Anammox 废水处理工程： 荷兰的Rotterdam，Lichtenvoorde，Olburgen；德国的Hattingen， Mechernich；日本的Mie Pref
4、ecture；澳大利来的 Strass；瑞士的Glanerland 和Kollikon 以及英国的Pitsea 。,Anammox 生物脱氮研究,澳大利亚昆士兰大学的JS Fuerst团队 ：研究细胞生物学，与奈梅亨大学团队一起探明了厌氨氧化体的结构及其生理特性。法国的国家基因测序公司Genoscope与Nijmegen团队、Vienna团队以及Munich团队 ：2005年完成了厌氧氨氧化菌Kuenenia Stuttgartiensis全基因组的测序。荷兰海洋研究中心的Jaap Damste研究团队 ：海洋生态系统有关厌氧氨氧化的研究，并探明了厌氧氨氧化菌特征性的阶梯烷细胞化学组分 。MP
5、E Bremen研究团队 ：首次证实海洋中存在厌氧氨氧化活性 。,Anammox 生物脱氮研究,浙大郑平教授团队：研究Anammox 菌种、工艺和设备。2008年， 成功将Anammox 应用于味精废水处理，建立了国内第一个Anammox 处理实际废水工程；中国科大俞汉青教授团队： 研究Anammox 污泥颗粒化，成功培育Anammox 颗粒污泥。大连理工杨凤林教授团队：分子生物学手段检测Anammox 的菌群组成。北京建筑工程学院郝晓地教授团队：侧重工艺及实际应用研究。华南理工大学周少奇教授、胡勇为教授团队： Anammox 处理垃圾渗滤液。广州微生物所沈萍教授团队： Anammox 处理垃
6、圾渗滤液。,分子生物学：在生物化学与遗传学、微生物学、细胞学、生物物理学等学科相结合的基础上发展起来的崭新学科。研究对象：生物大分子核酸（DNA 和RNA）。,分子生物学技术,荧光原位杂交技术 FISH,多聚酶链式反应 PCR,变性梯度凝胶电泳DGGE,DNA克隆,DNA测序及序列分析,分子生物学技术,荧光原位杂交技术：fluorescent in situ hybridazation，FISH20世纪70年代后期根据已知微生物不同分类级别上种群特异的DNA序列，以利用荧光标记的特异寡核苷酸片段作为探针，与环境基因组中DNA分子杂交，检测该特异微生物种群的存在与丰度。特点：可进行样品的原位杂交
7、，避免细菌的纯培养过程可有效反应环境样品中细菌数量及空间位置，并具有定性、定量分析和空间位置识别特点环境中特定微生物种群的鉴定、种群数量分析及其特异微生物跟踪检测，采用该技术已发现了许多新的微生物物种。,荧光原位杂交技术 FISH,多聚酶链式反应：polymerase chain reaction，PCR美国Cetus公司Mullis等1985年一套大量快速扩增特异DNA片段的系统，属DNA体外合成技术类似于生物体内DNA的复制过程，重复经过若干个变性、退火、延伸这3 步循环，就可以使目的DNA 扩增放大。通过PCR，可以在几小时内将一个分子的遗传物质成百乃至上亿倍的复制。该技术具有特异性强、
8、灵敏度高、快速、简便以及重复性好等特点和优点。经典PCR荧光定量PCR(Real-time PCR),多聚酶链式反应 PCR,环境样品DNA含量过低,变性梯度凝胶电泳 denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE：Myers等创建，属于DNA指纹图谱技术。PCR扩增产物在具有变性浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中具有不同的迁移位点，不同的GC含量在胶中产生不同分离的条带，每一条条带代表一个不同的微生物种群，通常用条带数目的多少来反映微生物种群的多样性，用条带的染色强度反映不同细菌种群的丰度。DGGE在微生物分子生态学方面的应用：对复杂微生态系统的解析成为可能对
9、微生物群落动态变化的研究成为可能,变性梯度凝胶电泳 DGGE,环境样品微生物分析存在的问题：得不到足够的目标物质进行分析微生物体内的蛋白质，能被纯化的部分几乎不到一半，真核细菌的蛋白质则更难得到分子克隆：将目标DNA片断插入一段自复制的DNA 分子（克隆载体）中，而后目标DNA片断就和载体复制在一起，将这个携带着目标DNA片断的载体在宿主细胞（如酵母菌）中克隆后就可产生大量的被插入的目标DNA片断。,DNA 克隆,DNA测序：采用高温使DNA双链变性，引物被退火后得到延伸。Taq DNA 多聚酶也是DNA 测序反应中常用的酶，它能使染料标记的DNA终端分布更加均匀，具有较高的测序准确度。DNA
10、 序列分析：测序后一个重要步骤。不同微生物有不同DNA序列，因此经过准确和合理的序列分析即能鉴定目标微生物。通过网络数据资源得到有关的序列信息应用软件在数据库中查询通过系统发育分析确定微生物在发育过程中种属关系。,DNA 测序及序列分析,细菌总DNA提取、特异性PCR扩增16S rDNA、16S rDNA克隆、16S rDNA基因测序和16S rDNA基因序列分析。,Anammox 菌的分子生物学鉴定,迄今为止共发现了9 个种的厌氧氨氧化菌，分别归在5 个属中，并建立了厌氧氨氧化菌科（Anammoxaceae）“Candidatus Brocadia anammoxidans”“Candida
11、tus Brocadia fulgida”“Candidatus Kuenenia stuttgartiensis”“Candidatus Scalindua brodae”“Candidatus Scalinduawagneri”“Candidatus Anammoxoglobus propionicus”“Candidatus Jettenia asiatica”“Candidatus Anammoxoglobus sulfate ” “Candidatus Scalindua sorokinii”,Anammox 菌的分子生物学鉴定,Strous等最先发现Candidatus Broca
12、dia anammoxidans并确定其16S rDNA 序列及在细菌进化树上的位置，B.anammoxidans的16S rDNA基因序列常被用来设计为特定的寡核苷酸探针，以用于荧光原位杂交(FISH)。Schmid等在德国几个污水处理厂中发现Candidatus Kuenenia stuttgartiensis ，它们的16S rDNA 序列形成了一个明显独立的种群，其中有85%的细菌与已发现的B.anammoxidans的16S rDNA序列相似性少于90%，因而认为是一种新的厌氧氨氧化菌。,Anammox 菌的分子生物学鉴定,革兰阴性菌专性厌氧菌红菌470nm有较强的吸收峰,多样，呈球
13、形、卵形等直径0.8-1.1m无荚膜壁表面有火山口状结构有少量菌毛,细胞壁细胞膜细胞内 厌氧氨氧化体 核糖细胞质 外室细胞质,生理特征,个体形态,细胞结构,Anammox 反应机理,Anammox菌生理生化特征,Anammox 菌,图2 颗粒污泥外观扫描电镜照片,图1 Anammox颗粒污泥,图3反应器内富集培养物,Anammox 菌,图4 颗粒污泥内部 Anammox 菌,图5 颗粒污泥超薄切片，透射电镜照片,羟胺和联氨氧化还原酶（HAO）厌氧氨氧化分解代谢的场所。,1、特有结构2、占细胞体积30%以上3、可完整分离4、单层不可渗透的膜包围5、几乎无RNA/DNA,厌氧氨氧化体,Anammo
14、x 反应机理,Anammox 反应机理,1997年，Van de Graaf 等通过15N 标记实验发现： 羟胺（ NH2OH）最可能是氨氧化的电子受体，并推测出其代谢途径。厌氧氨氧化菌首先NO2- 转化成NH2OH ，再以NH2OH 为电子受体将NH4+ 氧化形联氨（N2H4） ；N2H4 转化成N2 ，并为NO2- 还原成NH2OH 提供电子。试验中有少量NO2- 被氧化成NO3- , 推测可能是为厌氧氨氧化菌固定CO2 提供电子。生物转化过程中存在以下平衡关系: NH4+ : NO2- : NO3- = 1: 1.32: 0.26。,Fig. 6 Possible metabolic p
15、athway for Anammox,Anammox 反应机理,Anammox 影响因素,影响因素,pH,泥龄,氧,基质浓度,磷酸盐,有机物,温度,光,温度：适宜温度为30-40。pH： 影响细菌（电解质平衡和酶活性）和基质（ FA和游离亚硝酸）。氧：有抑制作用，微氧条件(0.5%空气饱和度) 可完全抑制，但该抑制作用是可逆的；大于18%空气饱和度，菌群不可恢复。,最适pH为6.7-8.3,Anammox 影响因素,基质浓度：氨浓度和硝酸盐浓度低于1000 mg/L不产生抑制；亚硝酸盐浓度超过100 mg/L产生明显抑制。泥龄：厌氧氨氧化菌生长缓慢，故泥龄越长越好。有机物：异养菌增殖较快，从而
16、抑制厌氧氨氧化活性。,Anammox 影响因素,磷酸盐：高浓度的磷酸盐有抑制作用。对Brocadia anammoxidans，加入1mM的磷酸盐对其活性无影响，但加入5mM完全抑制；而Kuenenia stuttgartiensis耐受力为20mM。光：厌氧氨氧化菌属光敏性微生物，光能抑制其活性，降低30%-50%的氨去除率。,Anammox 影响因素,Anammox 特点,同比例除氮,1,2,3,4,无机碳源CO2,自养菌红色生长慢,厌氧对氧敏感,优 点,已知的最简捷、最经济的生物脱氮途径,与传统硝化/反硝化相比,无需外加碳源,污泥产量少,无需供氧,无需外加碱度,倍增时间长，生长缓慢 抗冲
17、击负荷能力弱 对环境条件要求苛刻，DO、温度、pH、有机物等会对Anammox过程产生影响,缺 点,不同脱氮工艺比较,两相Sharon-Anammox工艺,单相CANON工艺,Anammox 应用现状,两相Sharon-Anammox工艺,Sharon：single reactor for high activity ammonia removal over nitriteSharon-Anammox工艺是一种将短程硝化和厌氧氨氧化联合的脱氮工艺。荷兰Delft大学2001年开发的。,两相Sharon-Anammox工艺,在两个反应器内，先在一个反应器内有氧条件下，利用氨氧化细菌将NH4+氧化
18、生成NO2-；然后在另一个反应器缺氧条件下，以NH4+为电子供体，将NO2-反硝化。,1 基本原理,NH4+ HCO3-+ 0.75O2 0.5NH4+ 0.5NO2-+ CO2+ 1.5H2ONH4+ 1.32NO2-+ 0.066HCO3+ 0.13H+ 1.02N2+ 0.26NO3-+ 0.066CH2O0.sN0.1s+ 2.03H2O,两相Sharon-Anammox工艺,分别在两个反应器内实现部分硝化和厌氧氨氧化，能优化两类细菌的生存环境，运行性能稳定。与传统硝化反硝化过程相比： 运行费用减少90% CO2排放量减少88%，不产生N2O有害气体 无需有机物 不产生剩余污泥 节省占
19、地面积,2 优点,荷兰鹿特丹污水处理厂,2002年世界上第一个生产性Sharon-Anammox工艺在荷兰鹿特丹污水处理厂正式运行，用于处理处理污泥消化液。设计处理流量为550m3/dSHARON 反应器有效容积1650 m3（=19.5m，H=5.75m）Anammox反应器容积70 m3（=2.2m，H=18m）,CANON：completely autotrophic nitrogen removal over nitrite 基于亚硝酸盐的完全自养脱氮CANON工艺是一种在同一个反应器内实现亚硝化和厌氧氨氧化的脱氮工艺。荷兰Delft大学提出的。,单相CANON工艺,亚硝化菌在有氧条件
20、下把NH4+化成NO2-，厌氧氨氧化菌则在无氧条件下把NH4+和NO2-转化为N2，即利用亚硝化菌和厌氧氨氧化菌的协同作用，在同一个反应器中完成亚硝化和厌氧氨氧化。,1 基本原理,单相CANON工艺,NH4+ + 1. 5 O2 NO2- + H2O + 2H+NH4+ + 1. 3NO2- 1. 02N2 + 0. 26NO3-+ 2H2ONH4+ + 0. 85O2 0. 43N2 + 0. 13NO3-+ 1. 3H2O + 1. 4H+,单相CANON工艺,1,自养型微生物不需要碳源,2,硝化50%的氨氮控制在亚硝化阶段节约碱度50%,3,限氧条件下进行节约供氧量理论上节约供氧62.5%,2 优点,厌氧氨氧化菌倍增时间长所需环境温度为中高温,Anammox菌特征信息,工程化应用困难,接种污泥的优化,环境因子的控制,合理优化工艺参数,展 望,展 望,实现高效脱氮,基质抑制动力学,如何解除基质抑制,Thank You !,
