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1、发酵过程参数相关分析原理及应用国家生化工程技术研究中心（上海）庄英萍 ,主要内容,发酵过程特性概述发酵过程的参数分类及检测理化相关生物相关应用举例下阶段工作展望,发酵过程特性概述,生物反应器中基因、细胞和反应器不同尺度网络之间存在着以时间为坐标多输入多输出的互动关系。表现在同一尺度下多过程的耦合，不同尺度下也往往会有不同过程发生。多尺度的研究方法要求从一个尺度观察另一尺度现象，即所谓跨尺度观察与控制，即可能提供在生物技术研究中所没有发现的现象。研究尺度间相互作用和耦合的原则和条件，只有这样才能进一步分析不同尺度下的各种子过程之间的相互量化关系，并与已知条件关联，构成描述复杂系统的综合模型或描述
2、。,发酵过程的特性,发酵过程多以分批操作形式进行，随着细胞生长和代谢过程的变化，各种测量参数（自动或手工实验室测定）随时间的变化而变化，通过对这些变化进行研究，有可能获得对发酵工艺和过程控制的有关认识，有利于发酵过程优化。有必要在计算机辅助下对过程进行时序性综合研究和分析。通过这些趋势曲线可以看出检测参数的多样性、时变性、相关耦合性和不确定性。,代谢曲线对照,常规发酵过程分析的缺陷性,分析发酵数据时，通过产品小试研究形成工厂生产的工艺控制为目标，把重点放在寻找最佳的操作点或某参数时序变化规律，在方法上主要依据人工经验的试差法，由此逐渐形成作为生产工艺管理的工艺规程。 -缺乏机理性认识，有局限性
3、。发酵过程动力学研究强调了参数趋势曲线的动态性并采用了过程数学模拟等进行仿真，可进一步总结经验规律，引入动态优化控制方法，为过程工艺优化研究提供了内容。 -强调参数各自的时序变化，缺乏数据时序变化之间的相关分析,发酵过程特性产生的原因,随着菌体生长和基质消耗，过程状态随时间变化的，因此测量参数的时变性反映了发酵过程的时变系统特征。由于发酵过程多容量性和严重非线性特征，表现在过程测量参数的离散性，主要是细胞代谢对环境因子的高度敏感性和细胞代谢的不可逆性，有时还表现在基因水平的启动和表达的影响，输入的初始条件极细微的差别会产生结果的巨大变化，即发酵过程混沌现象。由于对上述现象缺乏认识，更无法控制，
4、也就描述为测量参数的不确定性，应加强有关生物学机理的认识，才能在产品的工业发酵生产上取得突破性进展。,好氧生物反应器供氧情况变化引起的变化,当降低搅拌转速时，供氧速率（OTR）下降必然引起溶解氧浓度（DO）的下降，这是一个属于生物反应器系统中的过程传递和混和问题,如果DO下降到临界氧浓度以下时，就引起菌体呼吸强度的减弱，这实质上是氧成为限制性基质时的动力学行为,当DO继续下降，就可能产生厌氧代谢，代谢途径发生迁移，甚至发生胞内酶体系的改变 发生反应体系的结构性变化。,温度诱导的基因工程菌生长与表达,当用PL,C启动子构建表达载体时，PL,R启动子受噬菌体cI基因的负调控，cI基因产生的阻遏蛋白
5、结合在操纵基因上，阻止转录的进行。当在2830培养时，利用cI的温度敏感突变基因的突变体可以产生有活性阻遏蛋白，阻遏PL,R转录，细菌大量生长。温度上升到42，造成阻遏蛋白失活，PL,R解除阻遏，启动外源基因的高效转录和表达，从而合成大量有价值的外源蛋白。,参数曲线相关分析的优势,从发酵过程多尺度系统理论来看，参数趋势曲线相关有可能是某一尺度的线性或动力学行为，也可能是多尺度系统的结构性突变，因此用常规的单一尺度模式有时就无法解释过程中发生的许多现象。虽然这些过程检测大多是环境中的状态或操作量，但可以通过进一步分析，得到反映分子、细胞和反应器工程水平的不同尺度问题的联系，从而实现跨尺度观察和跨
6、尺度操作。,参数相关耦合的定义,参数耦合相关是指各种直接参数、间接参数以及实验室手工参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间发生某种耦合相关。这种参数相关是生物反应器中物料、能量或信息传递、转换、以及平衡或不平衡的结果，其微观因素也许只是发生在基因、细胞或反应器工程水平的某一个尺度上，但最终会在宏观过程中有所反映，这就为我们研究生物反应器中不同尺度的数据关联分析方法提供了线索。,发酵过程参数检测技术要求越来越高,微生物学生物化学分子生物学发酵工艺学化学工程现代控制理论各种工程开发,参数检测,(自动或手工检测),综合性研究：定性和定量的描述,工业生产,随着生物技术的快速发展，生化工程对传感技术、
7、计算机数据处理的要求越来越高，有望形成新的技术领域,在线计算机,（一）、 发酵过程的参数分类及检测,直接参数 通过传感器把非电量变化直接转化为电量变化，实时地送计算机数据采集。物理参数、化学参数、生物量参数就地测量(in line)、在线测量（on line） 手工参数:取样后实验室手工测量参数，离线输入。间接参数:由一些直接参数计算得到的各种反映过程特性的参数。反映菌体代谢活性、反应器工程特性、反应器操作特性等。,直接参数 物理参数 化学参数,生化反应过程中参数检测的复杂性,1)反应器上插入的传感器必须能耐热，经受高温灭菌；2)菌体以及其他固体物质极易吸附在传感器的表面，使一些传感器的使用性
8、能受到影响；3)生物反应过程往往是耗氧的过程，故在反应器内通气带来的气泡影响，往往对测量过程会造成干扰；4）使用在反应器上的传感器，其结构必须防止杂菌进入和避免产生灭菌死角，因而使传感器结构复杂或使其检测性能产生变化；5)生化反应过程中化学成分的分析往往是重要的检测内容，但对其电信号的转换困难。,带有计算机系统的的生物反应器检测参数示意图,间接参数,几个重要的间接参数计算公式,（二）、 参数相关基本特性,各种直接参数、间接参数以及手工测定的实验室参数随着发酵过程的进行而变化，并且参数间发生某种耦合相关，这种参数相关反映了发酵过程多尺度（水平）的问题特征。,发酵过程检测参数的特性,所检测到的参数
9、均是动态平衡的结果 检测参数 = 供给 消耗残留基质浓度对代谢的影响限制性基质的概念,代谢曲线一,发酵过程典型的代谢曲线,发酵过程参数相关分类,理化相关 纯属物质理化性质变化所引起的参数相关生物相关 生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间耦合相关,（三）、 理化相关,纯属物质理化性质变化所引起的参数相关 物理过程：物质或能量传递、混和、平衡或不平衡传热（加热或冷却） 温度发酵过程中打开冷却水的阀门引起罐温的下降 化学过程：发生某些化学反应的结果酸碱加入 ， 加入某种酸碱物质引起的pH的变化,理化相关,搅拌转速、通气流量、罐压力 溶解氧 DO,转速，气泡，气液接触表面积，KLa，OT
10、ROUR，DO,理化相关,通气流量 排气二氧化碳（ECO2 )通气流量 溶解二氧化碳（P） ,罐压测量与DO值,常规测量与代谢流方法测量的差异,加油泡沫 ， 气泡破裂释放2,理化相关（二）,理化相关,搅拌转速 CO2 释放后pH变化温度 DO 传感原理 ：T,OUR,DO,理化相关的普遍特性,理化相关对不同细胞对象具有普遍性，不因细胞生理活性的变化呈现不同的特性。 要注意过程数据采集的非同步性引起的误相关，特别要注意间接参数的变化产生的对过程研究的误导。,（四）、生物相关,生物相关是指通过生物细胞的生命活动所引起的参数之间耦合相关，主要体现在二种方式：其一，通过生物细胞生长代谢后引起的培养液物
11、性的变化，进而引起的参数相关。,菌体生长引起的生物相关特性,快速生长期时，培养液粘度上升，KLa下降，引起DO水平的变化。培养液粘度的变化也会引起溶解二氧化碳CO2与排气二氧化碳浓度ECO2的差异。轴向流桨叶所持留的微气泡与快速增长的菌体形成气溶胶现象，结构性粘度严重影响培养液的混和、传递特性。,菌体生长与参数相关,菌体生长时菌量必定增加，由于测定技术的困难，可用菌体干重、取样离心体积（PMV）、显示粘度、发酵液流出时间等表示。菌体生长时，OUR与CER发生变化。但是由于OUR与所利用的碳源的还原度有关，以及与菌体代谢途经密切相关，而CER主要涉及到碳平衡，所以一般宜以CER与菌体生长相关。氮
12、源在菌体代谢过程中不能作为能源供应，因此氮源的变化一般与菌体的维持无关。但是菌体生长时，必需由氮源提供生长所需的N元素材料。菌体生长所引起的培养液流变特性的变化，由此而引起反应器混和传递特性的变化。KLa就是一个反映这种特性的较容易测定的特征参数。磷是菌体生长的重要因子，它既是菌体生长时的组成材料又是微生物进行平衡生长的限制因素之一，因此在培养液中测定总磷或溶磷含量是必要的，由此可以与其他生长有关的参数相关联。,高搅拌转速时菌体生长与KLa变化,高转速时的头孢C菌丝形态变化,头孢菌素C发酵过程菌体生长引起的参数变化,头孢菌素发酵过程菌体生长与产量的关系,金霉素发酵后期发酵液稀化现象,发酵过程中
13、泡沫与KLa的关系,代谢引起的生物相关,通过生物细胞及代谢途径的不同所引起的活性变化,直接对控制对象特性发生影响。 菌体细胞代谢活性变化而直接引起的某测定参数的变化，即为代谢特性参数相关。 -代谢强度的变化 -代谢途径的变化 -引起的基质消耗或代谢产物形成的不同 代谢活性变化：环境条件的线性或动力学因素、细胞内某调节因子引起的代谢流迁移、基因水平的信息流。,发酵过程中补糖策略的实施,发酵过程中以某一营养物质作为限制性基质，采用营养物流加技术是常用的一种发酵调控策略。其中以流加糖（淀粉或葡萄糖）是最普遍采用的方法，归纳起来主要有以下几点理由。适应生物反应器的供氧能力，控制菌体生长速率与最大生物量
14、。在菌体生长期完成后，在细胞水平控制比生长速率，使菌体酶体系处于最有利于生产的状态，或控制比生长速率来解决基因水平上的分解代谢产物的阻遏作用。低浓度葡萄糖可以降低高浓度时所引起的分解代谢阻遏作用。,生物相关：排气氧浓度与溶解氧浓度的对应关系,不同发酵周期的EO2浓度与DO的几种对应关系。这种不同的对应关系是与不同操作条件和菌体呼吸强度有关的。,rpm,DO,ECO2,EO2,加糖,加糖,ECO2,ECO2,ECO2,EO2,EO2,EO2,DO,DO,DO,rpm,rpm,rpm,h,h,h,h,非碳源限制，临界氧浓度以下（变化不显著）,碳源限制，临界氧浓度以下（变化显著）,非碳源限制，临界氧
15、浓度以上（EO2变化不显著）,碳源限制，临界氧浓度以上（EO2变化显著）,补糖与排气CO2 、pH的关系,青霉素发酵过程，补糖将引起排气CO2浓度的增加和培养液pH下降，产生的二氧化碳和pH的变化可用下述简图描述：,pH,ECO2,加糖,(h),产生的二氧化碳可以用青霉素产生菌的生长和产物形成的化学简式来说明： 菌体生长：C6H12O6+NH3+3.3O2+0.06H2SO4 0.42C7.1H13.2O4.4N0.06S+3CO2+4.8H2O菌体维持：C6H12O6+6O2 6CO2+6H2O青霉素生产：C6H12O6+(NH4)2SO4 + 0.5O2 + PAA C9H12O4N2S+
16、2CO2+H2O 糖对pH的影响主要从二个方面起作用，一方面，由于糖的补入，立即被菌体利用形成CO2，溶解的二氧化碳使培养液的pH下降，另一方面，糖被菌体利用以后产生有机酸。,生物相关,补糖与氮源的利用关系,补料与磷含量的变化情况,补料与物料平衡,在菌体生长期或产物生产期，基础培养基中的碳源或中间补入的碳源被菌体利用后，经分解代谢和合成代谢，形成菌体生长、中间代谢物和能量消耗，这些都应符合物质平衡和能量平衡原理。-可把生物反应器中微生物细胞活动用化学元素的平衡式来表示。在多参数趋势曲线基础上，以物质守恒的原理进行相关分析。对OUR、CER、补糖量（或速率）、补氮量（或速率）、产物生成量和菌体生
17、成量等进行碳和氮平衡估算。如果发现不平衡现象，就有可能是某种未知的代谢产物形成。可以进一步结合发酵过程的其他现象，如RQ、pH值、菌丝形态等进行分析，得到有意义的结果。,生物相关：OUR与DO的基本相关特征,OUR,DO,rpm,加糖,DO和OUR之间的动力学特征,O2消耗与过程传递的物质平衡,时间(h),细胞水平 代谢调节,dc/dt =KLa( c*c)OUR rpm KLa KLa ( c*-c) OUR dc/dt 0 c 当葡萄糖为限制性基质时,D O,rpm,min,加糖,DO,rpm,min,OUR,CGLU,Cc,加入糖 CGLU OUR (菌体生理活性)OUR KLa( c*
18、-c) dc /dt 0 c ,生物相关：排气二氧化碳浓度和排气氧浓度的相关性,菌体耗糖形成二氧化碳时，必须提供氧作为生物氧化所需。因此在排气成份分析中，可以很明显地得到氧浓度降低和二氧化碳浓度升高的对应关系曲线，其相关深度可用呼吸商： RQ=(CER) / (OUR)来表示。,呼吸商(RQ)变化的生物学意义,表征不同的代谢途径 厌氧代谢、耗氧代谢 不同的耗氧代谢途径间的差异表征不同的基质利用情况 基质还原性强与弱的差异,生物相关：加入葡萄糖对RQ的影响,还原性较高的基质作碳源：葡萄糖加入RQ上升 结论：黄豆粉作碳源，以碳骨架通过氨基酸代谢进入菌体，有利于甲基丙二酰CoA形成，促进红霉素大环的
19、形成。曲线相关还进一步提出了黄豆饼粉利用的时间，利用方式和不同碳源间的竞争性利用特性，为过程工艺优化提供了重要线索。,生物相关：RQ 、CER 、DO 间的相关,RQ,CER,DO,RQ,RQ,RQ,CER,DO,DO,DO,Cglu,Cglu,时间（h）,时间（h）,时间（h）,时间（h）,加碳源,加碳源,葡萄糖碳源加入,还原性大的碳源,好氧发酵,厌氧发酵,多基质利用的参数相关变化,某抗生素发酵的糖与油利用转移,生物相关： 补糖与pH的相关性,常规的工艺控制点应有所改变,最佳pH值与由于物料流变化所引起的pH操作点的平衡的本质性差异，以 H+ 浓度平衡为例：,H+ 浓度平衡的算式,补糖与OU
20、R、 CER、菌量（x）、KLa相关特性 长周期、慢相关,KLa,OUR,CER,X,Rglu,时间（day）,1,2,相关性分析：发酵过程中加油的作用,消泡 释放CO2,(h),EO2,ECO2,DO,作为碳源利用,(h),RQ,OUR,CER,DO,改变流变特性,(h),OUR,CER,DO,KLa,加糖,加油,作为氧载体提高对氧亲和力,(h),相关性分析：搅拌转速与DO组成控制回路特性,电机,转速调节器,转速变送器,DO调节器,DO设定值,空气,发酵罐,串级调节系统主环调节：DO付环调节：转速,放大系数 K被调参数变化调节参数变化 DO rpm,工程尺度问题举例,通气搅拌与氧传递 KLa
21、 rpm , f Q KF(thtl) KLa KF轴向流搅拌器 富氧区、贫氧区、全釜混和与轴向流空气分布器与集流口 静态混和、泰勒涡柱、强化轴向流、减少桨叶层数、减小桨叶直径、降低功率消耗,不同尺度问题相关的举例,DO,OUR,CLC,Rpm DO 当低于临界氧浓度（)时，下降，细胞代谢由好氧向厌氧途径迁移。,分子水平基因工程血红蛋白 hemoglobin (VHB)对氧的亲和力提高（由图所示），临界氧下降。,VHB,（五）、参数相关特性与工艺操作分析,临界氧的确定 加油与消泡 补料漏糖的事故操作分析 消泡、气量与供氧 发酵不同时期的泡沫特性 过程误操作的判断 油与葡萄糖作为碳源的竞争性利用
22、,发酵过程的搅拌特性变化 逃液情况的判断 合理的代放操作研究 菌体结球形态与临界氧的迁移 基质利用的临界特性 基础培养基的各成分利用与代谢特性分析 种子质量指标的相关判断 菌体代谢特性的迁移,参数相关特性与工艺操作分析（二）,动态放罐点判断：基因工程疟疾疫苗高密度高表达,应用举例,梅岭霉素发酵过程中的代谢调控研究基因工程毕赤酵母的高表达过程的优化与放大鸟苷发酵过程优化研究头孢菌素C发酵过程放大研究,梅岭霉素发酵过程中的代谢调控研究,梅岭霉素的研究背景,江西农业大学70年代发现的可生产抗虫活性抗生素的产品长期来未实现产业化的症结是发酵单位较低，不具备产业化的可能性研究的角度是从一个全新的抗生素产
23、品开发来进行的研究初期，在反应器上单位低（50 g/mL ，摇瓶可达330 g/mL ）困惑了我们,氧消耗速率OUR与DO的基本相关特征,临界氧浓度的发现,反应器尺度剪切对MB生物合成影响,Fig.3.6 Morphology of S. nanchangensis fermentation in shake flask(48th h,1000),3275g/mL,575 g/mL,0,0,反应器尺度剪切对MB生物合成影响,Fig 3.9 Bioprocess parameters profiles of Streptomyces nanchangensis cultured in 50L B
24、ioreactor with turbine impeller (A) and slop impeller (B), respectively,83 g/mL,126 g/mL,铵离子对MB代谢中相关酶活的影响(1),Fig.3.15 The time course of specific activity of Glucose-6-Phosphate dehydrogenasein shake flask culture with different ammonium sulfate concentrations -control，-5mmol/L，-12.5mmol/L,Fig.3.16
25、The time course of Citrate syntheses in medium with different ammonium sulfate concentration (-control，-5 mM，-12.5 mM),Fig.3.17 The time course of SDH in medium with different ammonium sulfate concentration(-control，-5 mM，-12.5 mM),铵离子对MB代谢中相关酶活的影响(2),Fig.3.18 The time course of VDH specific activit
26、y at different ammonium sulfate condition(-control，-2.5mmol/L，-5mmol/L， -7.5mmol/L，-12.5mM),Fig.3.19 The time course of MCT of S. nanchangenesis cultivated in shake flask culture with 5mM（）and 12.5mM（）ammonium sulfate,Fig.3.20 The time course of FAS in medium with different ammonium sulfate concentr
27、ation(-5mM，-12.5mmol/L),酶学参数解释铵离子对梅岭霉素生物合成,NH4+对HMP和TCA途径促进（G6PDH,CS,SDH）VDH和MCT活性，前体增加 后期CS显著增加和SDH的减少 后期FAS合成脂肪酸增加高浓度的铵离子糖代谢加快，ATP量上升，而大量的ATP使菌体次级代谢减弱,毕赤酵母高表达优化与放大应用实例,毕赤酵母表达系统中不同碳源应用对比,1.以葡萄糖为碳源时接种后存在细胞生长的延迟期接种量10 %左右, 葡萄糖：1-2hr 甘油：不明显 2.细胞生长阶段工艺控制与呼吸熵变化 葡萄糖：0.9左右 甘油：0.6左右,葡萄糖,甘油,两种碳源条件下发酵过程特征比较,
28、3.由细胞生长期转化为蛋白表达期时，有明显的过渡期葡萄糖：5 hr左右甘油：3 hr左右4.诱导成功后，蛋白的表达受生长碳源的影响很小,glucose,glycerol,毕赤酵母表达系统的状态特征和优化策略,生长阶段：识别：RQ-碳源种类； CER或OUR -碳源； DO -批阶段和分批补料阶段的判定，氧限制优化：指数流加与DO控制结合高密度高比生长速率,50 L,500 L,12 T,鸟苷发酵过程关键技术研究,参数相关分析与状态方程建立,通过鸟苷发酵过程的数据采集发现：4040小时OUR下降，耗糖速率增加，氨氮用量增加 鸟苷产率迅速下降代谢流迁移,代谢途径迁移的酶学测试 HMP途经EMP途经
29、,跨尺度分析与工艺改进,确定以代谢流由EMP向HMP途径回复迁移为目标进行过程工艺优化，并以OUR的下降作为跨尺度操作的相关因子 发现调控因子A加入后短期内OUR的下降速度就开始放慢，到48小时开始维持稳定直至放罐，并且发酵后期的糖耗速率也变慢,工艺改进后实施效果,小试与中试规模 ： 17.2克/L 34克/L(60小时) 100M3生产规模 ： 16克/L 32克/L(60小时),阿维菌素发酵过程的参数相关分析,阿维菌素发酵过程的特点,典型的丝状菌液体深层发酵过程菌丝形态是重要参数菌丝形态会影响发酵液的流变特性、培养体系的传质和传热、影响目的产物合成菌体形态分化也与丝状微生物生理状态密切相关
30、发酵过程中的供氧与菌丝剪切力是一较难协调的矛盾,不同操作条件下菌丝形态差异,50L发酵罐不同初始碳源浓度批发酵过程菌丝图像 (100倍)（a）淀粉浓度13%，45h（左）、70h（右）；（b）淀粉浓度11%，45h（左）、68h（右）,图像分析技术在阿维菌素发酵过程中的应用,菌丝图像分析流程(a)原始图像(b)目标二值图(c)菌丝球核 (d)菌丝掩图（e）菌丝图,不同搅拌反应器对阿维菌素发酵过程的影响,50L发酵罐同时配置不同形式的搅拌浆,利用计算流体力学方法计算不同桨叶组合的速度矢量场情况,不同搅拌将情况下细胞代谢特性的研究,不同桨叶组合下除虫链霉菌球核面积，核区周长，菌丝球面积，圆形因子，
31、菌丝球密度，边缘菌丝密度的变化趋势Im01（）；Im02（）；Im03（）,生理实验结果,第一组：剪切力小、混合好、菌丝形态好，发酵单位：3500u/ml 第二组：菌量最小、菌球最小，发酵单位：3000u/ml 第三组：剪切力最小、混合较差、前期菌球大，发酵单位：2800 u/ml,阿维菌素发酵过程参数相关变化特性,OUR、CER、pH、RQ、Titer等变化趋势,发酵过程中-酮戊二酸、乙酸积累和总糖消耗过程曲线,（Acetic acid; Total sugar ；-ketoglutaric acid）,溶氧对菌形及产素的影响,51小时：高DO时187g/ml； 低DO时效价只有27g/ml
32、，提前放罐,DO1;,DO2;,Total sugar1;,total sugar2),低DO,高DO,后期补糖策略对发酵单效价的影响,补糖较差时，效价仅3600 u/ml,补糖较好时，效价可达5000 u/ml,基于代谢参数OUR的阿维菌素发酵补糖新工艺,常规发酵过程中OUR参数变化规律,以OUR为依据控制补糖的OUR变化图,以OUR为依据的补糖与对照效价对比图,头孢菌素C发酵过程放大,头孢菌素C的生物合成途径,L-a-氨基己二酸 L-半胱氨酸 L-缬氨酸 三肽合成酶 LLD-三肽 环化酶 O2 异青霉素N 异构酶 青霉素N 扩环酶 O2 脱乙酰氧头孢菌素C(DAOC) DAC合成酶 O2
33、脱乙酰头孢菌素C(DAC) 乙酰水解酶 乙酰转移酶 头孢菌素C 高耗氧是头C发酵特点之一,大型搅拌发酵罐设计制造,180M3发酵罐车间,大型空气压缩机,50升发酵罐（FUS-50L(A)）： 平均4万u/ml，最高达4.5万u/m1，用油少,l80M3工业发酵罐： 平均2.5万u/m1，最高达3万u/m1，用油增加30%,?,试验结果,大罐与小罐比较（307-149与50L2-10）大罐：100h后DO水平是限制产素速率的关键因素搅拌功率：560kw/180M3 3.2kw/M3,RQ值差异 32小时前，大罐与小罐的RQ值接近32小时大罐RQ值升高70小时左右，大小罐RQ值下降，但小罐更低。,
34、初步结论,小罐用油情况优于生产大罐，原因分析：加油量(单位发酵液体积)：大罐大于小罐？脂肪酶诱导：小罐优于大罐？混和情况：大罐搅拌功率：560kw/180M3 3.2kw/M3？考虑到100h后DO水平变化情况混和传递是放大时的主要矛盾,桨型的计算流体力学仿真通气量从0.5提高到1.2vvm时，发现桨间流型干扰,气含量分层现象严重通气短路现象,结论,搅拌系统设计不合理引起工业生产罐混和不均的严重问题出现发酵100小时高耗氧时的供氧不足出现顶部加油区到发酵底部的含油浓度梯度，虽然生产大罐加油量大，但实际耗油量减少也引起脂肪酶的诱导不均一性发酵单位下降，用油成本增加，含油发酵液提取困难，影响产品质
35、量,改造后搅拌桨模型,初步改造结果,2.5-3.0万u/m1 3.5万u/m1,红霉素发酵过程的优化与放大,项 目 背 景,红霉素及其衍生物市场需求大年销售额已超过35亿美元，位居抗生素销售额第三位限制我国参加国际市场竞争的关键因素红霉素组分要求 组分不合格的红霉素产品将严重影响后续衍生物的合成 降低生产成本 必须实现高效节能和绿色规模化生产,关键技术与难点,工业生产菌有效组分基因工程改造困难 国际上也未有文献报道 全局优化的发酵过程调控有难度 规模化生产中需要有效过程放大理论与方法分离纯化过程中需要节能减排先进分离技术,1. 首次成功应用代谢工程改造红霉素工业生产菌提高发酵有效组分,克服工业
36、生产菌株遗传操作的重大障碍成功实现异源表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMs)基因提高红霉素A产量,调控羟基化酶（EryK）和甲基化酶（EryG）表达 提高红霉素A产量,共获得9个有效工程菌，其中ZL1004, ZL1007生物效价提高近30 红霉素B无积累 红霉素C无积累,强化eryK表达减少红霉素B组份,同时强化eryK和eryG表达提高红霉素A产量,调节eryK和eryG表达比例提高红霉素A产量,调控羟基化酶（EryK）和甲基化酶（EryG）表达 提高红霉素A产量,出发菌,ZL1004,ZL1007,ZL1004, ZL1007正在进行50L生物反应器小试验证,2.红霉素发酵工艺优化 复杂
37、系统多尺度观点的应用,尺度：空间尺度(基因、细胞、反应器)与时间尺度信息流、物质流和能量流研究了跨尺度测量与控制的原理方法生物学与工程学相结合，解决局部与整体、过程动态与最终结果的关系,克服从单一生理调控机制出发的研究的局限性 解决发酵过程优化所面临的局部与整体的协调关系,50L实验室规模,数据软件包,120m3发酵罐,发酵过程优化的动态研究,培养基的优化、廉价原材料的替代,产物合成代谢流强化策略,其他发酵过程操作因子的优化,实现以宏观代谢流分析与控制为核心的发酵过程动态优化与生理代谢差异研究,小试与大罐的联动优化,氮源组成响应面分析图,优化筛选配方发酵代谢流差异,生产罐发酵过程优化与调整,氮
38、源调整试验、补糖时机选择、转速与流量控制、补料工艺、取消带放补水工艺,生产罐典型发酵代谢趋势曲线,原带放补水工艺与优化工艺代谢曲线,前期OUR代谢强度可作为跨尺度操作的调控因子,3.基于流场特性与生理特性相结合的大型发酵罐放大技术,370m3大型发酵罐,流场特性与生理特性的关系,流场特性CFD模拟,生理特性研究,多尺度参数相关分析,环境特性研究,（细胞内生命过程）,（多相流场复杂系统）,反应器流场特性研究具体实施方案,计算流体力学（CFD）的流场特性研究技术,CFD与耗氧特性溶氧分布,多点溶解氧（DO）等测定技术,模拟,理论推导,验证,流场特性模拟结果比较,速度矢量,气含率分布,湍动能分布,罐
39、底迟滞区整体气含率分布较均匀当前反应器形成的流场较均匀,370m3发酵罐配置与运行,计算机单参数多路数据采集与控制系统,杯式补料系统,搅拌系统,中央控制系统,流场特性验证结果-多点溶解氧(DO)测定,370m3发酵罐上参数的多点采集,上层DO,中层DO,底层DO,使代谢特征参数走势基本一致,发表的文章,Wang Y, Wang YG, Chu J, Zhuang YP, Zhang LX, Zhang SL. Improved production of erythromycin A by expression of a heterologous gene encoding S-adenosy
40、lmethionine synthetase. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 75:837842.（IF2.475）Wang Y, Wang YG, Zhang SL. High frequency transformation of the industrial erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol Lett, 2008, 30: 357-361.Yun Chen, Wei Deng, Jiequn Wu, Jiangchao Qian, Ju
41、Chu, Yingping Zhuang, Siliang Zhang and Wen Liu. Genetic Modulation of the Overexpression of Tailoring Genes eryK and eryG Leading to the Improvement of Erythromycin A Purity and Production in Fermentation of Saccharopolyspora erythraea. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74:1820-1828. （I
42、F4.004）Xiang Zou, Haifeng Hang, Changfa Chen, Ju Chu*, Yingping Zhuang, Siliang Zhang. Application of oxygen uptake rate and response surface methodology for erythromycin production by Saccharopolyspora erythraea. J. Ind Microbiol Biotechnol. 2008, DOI 10.1007/s 10295-008-0407-9. Xiang Zou, Haifeng
43、Hang, Ju Chu*, Yingping Zhuang, Siliang Zhang.Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50-l to 372-m3 scale. Bioresource Technology. 2008, DOI 10.1016/j.biortech.2008.09.017. （IF3.103）,132 m3 发酵罐 20个、157 m3 的发酵罐 23个和的1个372 m3 的发酵罐，目前发酵总容积
44、6500 m3，年产1800吨，国内最大的红霉素发酵工厂之一。,应用情况,生产罐工艺优化结果,工艺优化后，车间生产罐发酵单位平均提高了15%以上,生产车间近三个月生产罐发酵水平统计国内一般企业的发酵指数为0.28,单位：万元,经济效益,发酵过程优化与放大研究总况,文章、著作发表,发表论文：100余篇出版专著、著作：多尺度微生物过程优化，化学工业出版社,Study on Industrial Fermentation Process on Multi-scale and Its Optimization , Advance Biochemical Engineering/ Biotechnolo
45、gy , 2003 Volume（87） : Biomanufacturing 2004年3月出版,庆大霉素发酵OUR:2030 mol/h.m3,金霉素发酵 OUR:3040 mol/h.m3,泰洛菌素发酵OUR:40 50 mol/h.m3,鸟苷发酵OUR:4050 mol/h.m3,青霉素 (200h)OUR:5070 mol/h.m3,基因工程植酸酶发酵OUR:150200 mol/h.m3,基因工程毕赤酵母发酵（疟疾疫苗）OUR:200300 mol/h.m3,华蒙金河生物技术有限公司的生产车间现场（50L放大到120M3），从2000年9月至2001年3月间，饲料金霉素发酵从160
46、00u/ml提高到21000u/ml，新增利润1176万元，新增创汇883万元。,远程通讯与异地数据传送与分析,为多家企业的生物技术产业发展做出贡献,在多个传统生物技术产品中取得突破,企业 产品 原产量 优化后产量 放大规模内蒙金河实业 金霉素 16000u/ml 21000u/ml 50L120M3浙江海正药业 阿维菌素 1500u/ml 2500u/ml 80M3湖南中湘康神 红霉素 5000u/ml 6000u/ml 50L- 50 M3肇庆星湖生物 肌苷 20g/L 40g/L 50L60M3肇庆星湖生物 鸟苷 16g/L 34 g/L 50L100M3西安恒通药业 泰乐菌素 7000
47、u/ml 10000 u/ml 50L120M3 山东胜利股份 海南霉素 1500 u/ml 3000 u/ml 50L50M3华药华胜制药 链霉素 2.4万u/ml 2.7万u/ml 50L50M3江西东风药业 青霉素 4.5万u/ml 5.5万u/ml 50L50M3,在多个现代生物技术产品中取得突破,企业 产品 原产量 优化后产量 放大规模永业农科 基因工程 800FTU/ml 2500 FTU/ml 50L10M3 植酸酶英国GMX公司 PIP 0.3g/L 2.1g/L 500L医科院 毕特螺旋霉素 1000u/ml 2500u/ml 30L二军医大 疟疾疫苗 70mg/L 2.3g
48、/L 50L上海凯曼生物 Apo-AI 4.5 g/L 50L -milano,工程中心下阶段优化研究中的研究思路,国家级项目情况,项目总体技术路线,常规育种基因工程改造,代谢流研究,高通量筛选,小 试(50L),中 试(3m3、10m3),生产规模(160m3/300m3),微观代谢流分析,多尺度相关分析和差异分析,宏观代谢流分析,传感系统/数据分析系统扩展,计算流体力学研究,代谢谱,转录谱,计算、发酵罐设计,验证、代谢流研究,验证、代谢流研究,计算、发酵罐设计,各种参数传感器技术,发酵尾气分析过程质谱仪,建立新型跨尺度参数在线检测、研究方法,在位细胞形态显微观察仪,生物过程工程实验室,建立
49、新型跨尺度参数在线检测、研究方法,工业生物过程远程诊断研究室,建立生物过程在线数据处理网络系统与数据库,实验室网络拓扑图（为异地远程诊断提供技术平台）和数据中心实景图,菌种筛选与基因工程改造,常规育种技术基因工程改造 代谢产物的多基因合成 次级代谢全局基因调控 转录、表达、代谢-系统生物学vgb基因应用辅因子代谢工程,用于高通量筛选的装置技术应用与研制,H测量与计算机补料控制摇床微型化生物反应器应用与研制,探索工业生产过程的代谢流分析与过程优化、基因工程改造,如何采用瞬时同位素测定代谢流等代谢流分析方法，深入研究高产菌株生长特性与代谢规律，寻找抗生素 生物合成的关键限制性步骤，进而针对限制性步
50、骤进行基因操作，尝试进一步提高产素水平。以13等稳定性同位素测定的微观代谢流分析与过程优化、菌种改造相结合。,Parallel metabolic pathways,Metabolic cycles (futile cycle),Bidirectional reaction step,Energy metabolites,Why the Isotopomer Labeling Approach?,When does Stoichiometric MFA fail?,Revisiting the 13C-label distribution of the non-oxidative branch
