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1、发酵过程染菌及其防治,第八章,发酵染菌：指在发酵过程中生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养。,第一节 染菌对发酵的影响,一、染菌对不同发酵过程的影响二、染菌发生的不同时间对发酵的影响,由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产品的产量大为降低。,一、染菌对不同发酵过程的影响,青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破
2、坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。,一、染菌对不同发酵过程的影响,种子培养期染菌,二、染菌发生的不同时间对发酵的影响,种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖，
3、此时，微生物菌体浓度低，培养基地营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。,发酵前期染菌,二、染菌发生的不同时间对发酵的影响,在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌。染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。,发酵中期染菌,二、染菌发生的不同时间对发酵的影响,发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生
4、成。有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌体自溶，致使发酵液发粘，产生大量的泡沫，代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现、快处理。,发酵后期染菌,二、染菌发生的不同时间对发酵的影响,由于发酵后期培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物的影响也是不同的，如抗生素、柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大；肌苷酸、谷氨酸等地发酵，后期染
5、菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。,第二节 发酵异常现象及原因分析,一、种子培养和发酵的异常现象二、染菌的检查和判断三、发酵染菌原因分析,发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平，使生产蒙受损失。对此应及时查明原因，加以解决。,一、种子培养和发酵的异常现象,1、 种子培养异常 表现为培养的种子质量不合格,菌体生长缓慢菌丝结团代谢不正常,培养基原料质量下降、菌体老化、灭菌操作失误、供氧不足、培养温度偏高或偏低、酸碱度调节不当；接种物冷藏时间长或接种量过低而导致菌体量少；接种物本身质量差等,在培养过程
6、中有些丝状菌容易产生菌丝团，菌体仅在表面生长，菌丝向四周伸展，而菌丝团的中央结实，使内部菌丝的营养吸收和呼吸受到很大影响，从而不能正常地生长。通气不良或停止搅拌导致溶解氧浓度不足；原料质量差或灭菌效果差导致培养基质量下降；接种的孢子或菌丝保藏时间长而菌落数少，泡沫多；罐内装料小、菌丝粘壁等会导致培养液的菌丝浓度比较低；接种物种龄短等导致菌体生长缓慢造成菌丝结团。,代谢不正常表现出糖、氨基氮等变化部正常，菌体浓度和代谢产物不正常。原因很复杂，与接种物质量和培养基质量差、培养环境条件差、接种量小、杂菌污染等有关。,2、发酵异常,菌体生长差pH值过高或过低溶解氧水平异常泡沫过多菌体浓度过高或过低,菌
7、体生长差,由于种子质量差或种子低温放置时间长导致菌体数量较少、停滞期延长、发酵液内菌体数量增长缓慢、外形不整齐。种子质量不好、菌种的发酵性能差、环境条件差、培养基质量不好、接种量太少等均会引起糖、氮的消耗少或间歇停滞，出现糖、氮代谢缓慢现象。,H值过高或过低,发酵过程中由于培养基原料质量差、灭菌效果差、加糖、加油过多或过于集中，将会引起pH的异常变化。pH值变化是所有代谢反应的综合反映，在发酵的各个时期都有一定规律，pH值的异常就意味着发酵的异常。,发酵过程中的溶解氧水平发生异常变化一般就是发酵染菌发生的表现。由于污染的杂菌好氧性不同，产生溶解氧异常的现象也是不同的。对于特定的发酵过程，工艺确
8、定后，排出的气体中CO2含量的变化是规律的。,杂菌是好氧性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直到接近于零，且在长时间内不能回升；杂菌是非好氧性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。,正常发酵过程中，发酵初期菌体处于适应期，耗氧量很少，溶解氧基本不变；当菌体进入对数生长期，耗氧量增加，溶解氧浓度很快下降，并且维持在一定的水平，这阶段中操作条件的变化会使溶解氧有所波动，但变化不大；发酵后期菌体衰老，耗氧量减少，溶解氧又再度上升；当感染噬菌体后，生产菌的呼吸作用受抑制，溶解氧浓度很快上升。发酵过程感染噬菌体后，溶解氧的变化比菌体浓度更灵敏，能更好的预见染菌的发生。,
9、染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排气中CO2含量的异常变化，如杂菌污染，糖耗加快， CO2含量增加；噬菌体污染后，糖耗减慢， CO2含量减少。因此，可根据CO2含量的异常变化来判断是否染菌。,溶解氧水平异常,一般在发酵过程中泡沫的消长是有一定规律的。但是，由于菌体生长差、代谢速度慢、接种物嫩或种子未及时移种而过老、蛋白质类胶体物质多等都会使发酵液在不断通气、搅拌下产生大量的泡沫。除此以外，培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖受到破坏产生的氨基糖会抑制菌体的生长，也会使泡沫大量产生，从而使发酵过程的泡沫发生异常。,泡沫过多,在发酵生产过程中菌体或菌丝浓度的变化是按其固有的规律进行的。但是
10、，如罐温长时间偏高，或停止搅拌时间较长造成溶氧不足，或培养基灭菌不当导致培养条件较差，种子质量差菌体或菌丝自溶等均会严重影响到培养物的生长，导致发酵液中菌体浓度偏离原有规律，出现异常现象。,菌体浓度过高或过低,二、染菌的检查和判断,发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。因此，生产上要求能准确、迅速的检查出杂菌的污染。目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检查法、肉汤培养法、平板（双碟）培养法、发酵过程的异常观察法（如溶氧量）等。,用革兰氏染色法（Grams stain）对样品
11、进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征进行区别、判断是否染菌。如发现有与生产菌形态特征不一样的其它微生物的存在，就可判断为发生了染菌。此法检查杂菌最简单、最直接、最常用。必要时还可进行芽胞染色或鞭毛染色。,1、显微镜检查法（镜检法）,通常用葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待测样品直接接入经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37、27进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断是否有杂菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时此法也可用于噬菌体的检查。,2、肉汤培养法,葡萄糖酚红肉汤0.3牛肉膏、0.5葡萄糖、0.5NaCl、0.8蛋白胨、0
12、.4酚红溶液，pH 7.2,将待测样品在无菌平板上划线，分别于37、27进行培养，一般24h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可将需要检查的样品先置于37培养6h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。,3、平板划线培养或斜面培养检查法,注意点,无菌试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应（红色黄色）或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，并经镜检等其它方法确认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。一般来讲，无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至本批（罐）放罐后1
13、2h，确认为无杂菌后才能弃去。无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。,三、发酵染菌原因分析,发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验教训，积极采取必要措施，把杂菌消灭在发生之前。如果对已发生的染菌不作具体分析，不了解染菌原因，未采取相应的措施来防治染菌，将会对生产造成严重的后果。造成发酵染菌的原因很多，且因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不善等造成各厂污染杂菌的普遍原因。,上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析,对于每一个发酵过程而言，污染的杂菌种类的影响是不同的。,1、染菌的杂菌种类分析,2、发酵染菌
14、的规模分析,大批量发酵罐染菌部分发酵罐染菌个别发酵罐连续染菌（如果采用间歇灭菌工艺，一般不会发生）连续染菌,大都由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体或罐器是否清洁等。一般设备渗漏引起的染菌，会出现每批染菌时间向前推移地现象。,染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养期染菌。通常是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素等原因而引起染菌。在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌。大部分也是由于种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素、无菌空气等原因而引起。发酵后期染菌大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起。,3、
15、不同污染时间分析,第三节 杂菌污染的预防,一、种子带菌及其防治二、空气带菌及其防治三、操作失误导致染菌及其防治四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治,原因措施,一、种子带菌及其防治,保藏斜面试管菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌、种子培养所涉及的设备和装置染菌。,严格控制无菌室的污染，根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理。在制备种子时对砂土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理，防止杂菌的进入而受到污染。为了防止染菌，种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度，保存温度尽量保持相对稳定，不宜有太大变化。对每一级种子的培养
16、物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受杂菌污染后才能使用。对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理，保证在利用灭菌锅进行灭菌前，先完全排除锅内的空气，以免造成假压，使灭菌的温度达不到预定值，造成灭菌不彻底而使种子染菌。,要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。,二、空气带菌及其防治,加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口，如提高采气口的位置或前置粗过滤器，加强空气压缩前的预处理，如提高空压机进口空气的洁净度。设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中空气带油、水量，提高进入过
17、滤器的空气温度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态，防止空气冷却器漏水，防止冷却水进入空气系统等。设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。选用除菌效率高的过滤介质，在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻而造成短路，避免过滤介质烤焦或着火，防止过滤介质的装填不均而使空气走短路，保证一定的介质充填密度。当突然停止进空气时，要防止发酵液倒流入空气过滤器，在操作中要防止空气压力的剧变和流速的急增。,通常对于淀粉质培养基地灭菌采用实罐灭菌较好，一般在升温前先通过搅拌混合均匀，并加入一定量的淀粉酶进行液化；有大颗粒存在时应先经过筛除去，再行灭菌；对于麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多的培养基，采用罐
18、外预先配料，再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为有效。在灭菌升温时，要打开排气阀门，使蒸汽能通过并驱除罐内冷空气，一般可避免“假压”造成染菌。要严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫的大量产生。避免蒸汽压力的波动过大，应严格控制灭菌温度，过程最好采用自动控温。发酵过程越来越多的采用自动控制，一些控制仪器逐渐被应用。一般常采用化学试剂浸泡等方法来灭菌。,三、操作失误导致染菌及其防治,设备渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀（发酵代谢所产生的有机酸等发生腐蚀作用）、电化学腐蚀、磨蚀、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。,四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治,一、种
19、子培养期染菌的处理,6、杂菌污染的挽救与处理,一旦发现种子受到杂菌污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。采用备用种子，选择生长生产无染菌的种子接入发酵罐，继续进行发酵生产。如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产的正常进行。,第四节 杂菌污染的挽救和处理,当发酵前期发生染菌后，如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵；如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则
20、可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。,二、发酵前期染菌的处理,发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加入适当地杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其它措施，进行处理。如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐。对于没有提取价值得发酵液，废弃前应加热至120以上、保持30min后才能排放。,三、发酵中、后期染菌处理,染菌后的发酵罐在重新使用前，必须在放罐后进行彻底清洗
21、，空罐加热灭菌至120以上、保持30min后才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。,四、染菌后对设备的处理,症状根源防治挽救措施,如：发酵液光密度不上升或回降；pH值逐渐上升；氨利用停止；糖耗、温升缓慢或停止；产生大量泡沫，使发酵液呈粘胶状；镜检时菌体数量显著减少，甚至找不到完整菌体；发酵周期延长、产物生成量减少或停止等,环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源, 严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”； 做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌； 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内； 抑制罐内噬菌体的生长； 轮换使用菌种或使用抗性菌株,尽快提取产品药物抵抗（如四环素可抵抗乳糖杆菌噬菌体；吐温60等表面活性剂可抑制噬菌体的增殖和吸附）罐内灭噬菌体法（60-70，5min可灭活）,第五节 噬菌体污染及其防治,本章要求,掌握发酵染菌的影响、判断、防治及处理掌握噬菌体污染的症状及防治方法,
