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1、基因工程 是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞，并使重组基因在受体细胞中表达，产生人类需要的基因产物的技术。,基因工程的产物：,（1）能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列（2）使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷 酸二酯键断开。,1.作用：,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,具有特异性。 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，,2.作用特点：,大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成。,限制酶的识别序列：,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,回文序列,中轴
2、线,在G与A之间切割,EcoRI限制酶的作用,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR），专门识别DNA分子中含有“GAATTC”这样的序列，一旦找到就从G和A之间剪断。,黏性末端,黏性末端,EcoRI限制酶的切割,SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。,中轴线,SmaI限制酶的作用,在G与C之间切割,平末端平末端,SmaI限制酶的切割,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,产生黏性末端或平末端,3.结果：,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,4.切割对象：,目的基因和运载体,练习使用EcoRI剪切质粒和目的基因,质粒,目的基
3、因,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生相同的末端。,思考题：,5. 来源,现在已经从约300种微生物中分离出了约4000 种限制性内切酶(限制酶)。,寻根问底,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制
4、酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,作用:,作用原理：,催化磷酸二酯键形成,把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来。,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,类型：,EcoliDNA连接酶,T4DNA连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T4噬菌体,恢复磷酸二酯键,只能连接黏性末端,能连接黏性末端和平末端(效率较低),相同点,差别,（二）“分子缝合针”DNA连接酶,?,DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？,将外源基因送入受体细胞。,(三)基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”,载体的作用：,质粒噬菌体的衍生物
5、动植物病毒等,载体的种类：,大肠杆菌结构模式图,DNA,质粒载体结构模式图,目的基因插入位点,氨苄青霉素抗性基因,复制原点,载体需要具备的条件,已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。,对照组：不添加抗生素,实验组1：添加一定浓度的四环素,实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素,实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素,练习,既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因,只含有抗四环素基因,只含有抗氨苄青霉素基因,既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因,将含有目的基因的DNA与经特定的酶切后的载体（质粒）进行连接形成重组DNA，重组DNA可能有几种？,思 考,结果分析：单纯用EcoR限制酶切割，再连接后的产物有：（1）目的基因与质粒连接的产物（2）目的基因与目的基因连接的产物（3）质粒与质粒连接的产物（4）目的基因自身环化的产物（5）质粒自身环化的产物,思考：,如何避免质粒和目的基因的自身环化和随意连接？,用不同限制酶切割目的基因和质粒,Thank you,
