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1、分子生物学实验,一、实验设计二、实验操作指导教师：林 凤,实验设计,基因工程菌的构建,载 体 目的基因,酶切,PCR扩增，酶切,载体片段,目的基因片段,+,连接,重组质粒,转化,重组子阳性鉴定,1、载体多克隆位点2、缓冲溶液3、温度4、末端的性质,酶切位点设计,载体与目的基因的连接,1、粘末端2、平末端3、对照实验,连接产物的转化,1、核酸电泳检测2、对照实验：空白和阳性,阳性重组子的鉴定,1、限制性酶切法2、-互补法3、插入失活法4、杂交筛选法,construction of expression vector,NcoI CCATGG GGTACCXhoI CTCGAG GAGCTC,实验操
2、作,碱裂解法小量制备质粒DNA-pUC18,接种子液至75 g/ml Amp的5 ml LB培养基,37 ，OD600 1.0,加氯霉素 100 g/ml,37，过夜,1.4 ml培养液,4, 6000 rpm, 2 min,沉淀加100 l 冰预冷溶液,剧烈振荡,弃去上清，尽可能除净培养液,室温，20 min,200 l 新配制溶液，快速颠倒混匀,冰浴5 min,150 l 冰预冷溶液，温和振荡,冰浴5 min,上清加入450 l饱和酚，混匀,4, 12,000 rpm，2 min,上清加入450 l氯仿-异戊醇，混匀,4, 12,000 rpm，2 min,上清加入300 l异丙醇，-20
3、，30 min,4, 12,000 rpm离心5 min,500 l 70% 乙醇洗涤沉淀,4, 12,000 rpm，2 min,弃上清，空气干燥10 min,20 l TE溶解质粒DNA,4, 12,000 rpm，5 min,DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定,DNA的酶切与连接,酶切反应体系 1 2ddH2O 19l 19l 10buffer 2.5l 2.5l 质粒DNA pBR322 3l pUC18 3lEcoRI 0.5l 0.5l 37 ，1 h65 ，1015 min终止反应取4l 样品，加入10Loading buffer 0.5l ，核酸电泳,连接反应体系 ddH2
4、O 8.5l 10buffer 4.5l酶切DNA pBR322 20l 酶切DNA pUC18 10lT4 DNA ligase 1l 16 ，15 h取10l连接产物，核酸电泳（上步剩余酶切产物做对照） 其余连接产物用于转化,重组DNA的转化,（一）CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 0.3 ml菌种接种于30 ml LB培养基,37 ，190 rpm,OD600 0.375，冰浴10 min,4, 6000 rpm, 10 min,弃上清，加4 ml冰预冷 0.1M CaCl2,冰浴10 min， 4, 6000 rpm, 10 min,弃上清, 加入1 ml 0.1M CaCl2，分装200 l/管,（二）转化反应分别加入连接产物20 l, 阳性对照质粒pBR322 1 l, 阴性对照pUC18 1 l, 空白对照,冰浴30 min,42 , 90 s,冰浴1-2 min,弃500 l 上清, 连接产物取100 l , 10 l各涂一平板, 空白，阳性对照和阴性对照200 l各涂一平板,加入800 l LB培养基,37 水浴5 min,37 ，缓慢摇，复苏45 min,37 ，12-16 h,观察转化子的出现,6000 rpm, 5 min,转化子DNA的快速鉴定,PCR扩增技术,
