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1、基因工程的基本操作程序,苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因。让细菌的毒蛋白基因在棉花细胞中表达，可培育出抵抗棉铃虫害的抗虫棉。想一想需要做哪些关键工作？,普通棉花抗虫棉,毒蛋白基因,苏云金芽孢杆菌,棉花细胞,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花含抗虫基因,转基因棉花产生相应蛋白质,转基因棉花有抗虫特性,基因工程的基本操作程序,一、目的基因的获取,二、基因表达载体的构建,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,主要是编码蛋白质的结构基因,获取方法：1、从基因文库中获取目的基因2
2、、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成,外显子,内含子,原核生物基因,真核生物基因,补充:,1、从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,基因组文库,部分基因文库(CDNA文库),某生物体内全部DNA,许多DNA片段,受体菌群体,1、从基因文库中获取目的基因,基因组文库,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,部分基因文库（cDNA文库）,IMN,基因组文库的构建,概念：,原理：,PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术 。,体外DNA复制
3、,前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。,条件：,（1）模板DNA( 需含有目的基因 ),（2）四种脱氧核苷酸(dNTP),（3）耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）,2、利用PCR技术扩增目的基因,3、通过DNA合成仪用化学方法人工合成,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的基因,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,二、基因表达载体的构建-核心,基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口两个黏性末端,复制原点
4、+启动子+目的基因+终止子+标志基因,基因表达载体的组成,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,2.将目的基因导入动物细胞,显微注射技术,3.将目的基因导入微生物细胞,Ca2+处理,1.将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法：,显微注射技术,提纯基因表达载体,2.将目的基因导入动物细胞,3.将目的基因导入微生物细胞,常用原核生物作为受体细胞的原因： 原核生物特点：繁殖快、多为单
5、细胞、遗传物质相对较少等,方法:,Ca2+处理,四、目的基因的检测与鉴定,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,基因探针：目的基因片段用放射性同位素标记,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成,复制原点 + 目的基因 + 启动子 + 终止子 + 标记基因,农杆菌转化法、基因
6、枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法,DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术,分子检测外的个体水平鉴定,巩固练习:1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗性基因的主要作用是 ( )A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测C.增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接2.在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于 ( )A.目的基因的提取和导入B.目的基因的提取和检测C.目的基因与载体的结合和导入D.目的基因的提取与载体结合,B,D,3.在遗传工程技术中,下列何种目的基因一般以直接分离的方法获得 ( )A.人的胰岛素基因 B.蚕的蚕丝蛋白基因C.芽孢杆菌的抗虫基因 D.菜豆储藏蛋白基因4.1976年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达,此文中的表达是指该基因在大肠杆菌 ( )A.能进行DNA复制B.能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素,C,C,5.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的,在基因操作的基本步骤中,不进行碱基互补配对的步骤是 ( )A.人工合成目的基因B.目的基因与载体结合C.将目的基因导入受体细胞D.目的基因的检测和表达,C,
