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1、实验1大肠杆菌的培养和分离,指结构简单,形体微小的单细胞、多细胞或无细胞结构的低等生物。,一、微生物,90%以上的微生物是对人类有利的。,微生物的类群,细菌细胞由外向里依次有: 鞭毛和菌（纤）毛荚膜细胞壁细胞膜细胞质拟核区(类核区),1、细菌的构造,图1-3 细菌的结构,繁殖方式：分裂繁殖（20min分裂一次）,2、菌落：,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。,菌落,细菌的菌落特征因种而异,碳源氮源生长因子无机盐水,微生物需要的五大类营养要素物质,3、培养基,培养基（培养液）是人工方法配制而成的，是微
2、生物生存的环境和营养物质。,1）培养基的成分,（a）细菌培养基： 特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠 酸碱度：中性偏碱（b）霉菌培养基： 特殊成分：无机物或添加蔗糖的豆芽汁 酸碱度：中性偏酸,2）培养基的种类,（1）按物理性质分: a.固体培养基 通常加琼脂，作为凝固剂 （凝固剂的要求：不被微生物利用，又可使培养基固化，且不影响培养基中的其他营养物被细菌吸收） 作用：分离（纯化）细菌、计数、保留菌种等 b.液体培养基 不加琼脂等凝固剂其它成分与固体培养基相同 作用：培养细菌,液体培养基：,表面生长,均匀混浊生长,沉淀生长,固体培养基：菌落,（2）根据化学成分分合成培养基成分明确天然培养基成分
3、不明确,（3）按培养基的用途分类,a基础培养基（LB培养基）:含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是上面提及的天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。b营养培养基（加富培养基）:在基础培养基中加入某些特殊营养物质，如血液、血清或生长因子等。用以培养对营养要求高的微生物。,c、选择培养基在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,如尿素固体培养基可以分离以尿素为氮源的微生物。d、鉴别培养基在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,如伊红和美蓝,和大肠杆菌的代谢产物结合,使菌落呈深紫色,并带有金属光泽,可以用来鉴别大肠杆菌
4、,二、无菌操作技术,1、概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。,2、无菌技术包括：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近 进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。,（1）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。,3、消毒与灭菌的概念及两者的
5、区别,（2）灭菌的定义：,以化学或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,（3）具体无菌处理方法：（a）消毒：,1）对接种室、接种箱或超净工作台先用 紫外线 进行物理消毒，然后用 酒精 增强消毒效果。2）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒。3）日常生活经常用到的是煮沸消毒法。4）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法。,巴氏消毒法是法国科学家巴斯德创建的一种食品保鲜方法，最早是为了延长法国葡萄酒的保质期。这是一种能将绝大多数的细菌杀死的低温消毒方法。 牛奶消毒也用巴氏消毒法。 具体措施：
6、牛奶在62.8摄氏度下30分钟。 优点：最大限度地保持了牛奶的品质，颜色，味道和营养。,(b)灭菌：,1）灼烧灭菌 接种环、玻璃刮刀 试管口2）高压蒸气灭菌： 1kg/cm2压力、121、15min,培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、三角刮刀、接种环、镊子、无菌水、培养基,高压蒸汽灭菌不会破坏培养基的营养成分。,三、分离细菌方法,1、划线分离法（P20） （视频） 1）灼烧接种环； 2）接种环冷却后，蘸取带菌培养物 3）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养 基上划线。划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。,2、涂布分离法,1) 稀
7、释菌液 （10-5 10-7倍） 用无菌吸管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。 3) 涂布 用无菌吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。4) 培养 将培养皿倒置，在37恒温箱中培养2448h。,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操
8、作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,思考,四、大肠杆菌的培养和分离1、大肠杆菌（1）特性： 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 （2）用途： 基因工程技术中被广泛采用的工具2、培养： LB液体培养基 扩大培养 LB固体培养基 分离,3、分离,培养基灭菌,将LB液体和固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌,将灭菌后冷却到60的LB固体培养基倒入灭菌过的培养皿中，制作平面培养基.,将大肠杆菌从斜面接种到LB液体培养基中，然后在37摇床中震荡培养12h。,用接种环取震荡培养后的菌液，并在固体培养基上划线，然后将划线后的培养皿倒置与37的恒温
9、培养箱中培养1224h，观察划线末端的菌落生长情况.,用接种环取单菌落，用划线法接种于斜面上，在37的恒温培养箱中培养24h，再放入4的冰箱中保存 。,倒平板技术,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,菌种的保存接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。,1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,思考,可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿
10、底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,
