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1、抗原抗体检测技术,毕建虹,主要内容,抗原抗体反应的原理抗原抗体的反应特点影响抗原抗体反应的因素抗原抗体反应的类型,抗原抗体反应（antigen-antibody reaction）是抗原与相应抗体的特异性结合反应。既可在体内作为体液免疫应答的效应机制自然发生，也可在体外作为免疫学实验的结果出现。由于抗体主要存在于血清中，且临床上多用血清标本进行实验，所以体外实验中的抗原抗体反应曾被称作血清学反应（serological reaction）。,第一节 抗原抗体反应的原理,抗原抗体反应可分为两个阶段第一为抗原与抗体发生特异性结合的阶段，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。第二为可见反应阶段，抗原抗
2、体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）影响下，进一步交联和聚集，表现为凝集、沉淀、溶解、补体结合介导的溶解现象等肉眼可见的反应；此阶段往往需要数分钟至数小时。,亲水胶体转化为疏水胶体抗原抗体的结合使电荷减少或消失，电子云也消失，蛋白质内亲水胶体转化为疏水胶体。加上电解质（如NaCl），则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。,抗原抗体结合力抗原和抗体通过非共价键结合，虽是互补性的特异性结合，但并不形成牢固的共价键。抗原与抗体这种弱的结合力与静电引力、范德华引力、氢键结合力、疏水作用力相关。抗原与抗体之间高度的互补结构恰好为这些结合力的发挥提供了条件。,第二节 抗原抗体
3、的反应特点,特异性抗原抗体的结合实质上是抗原表位与抗体超变区中抗原结合点之间的结合。如果两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定表位或者抗原抗体构型部分相同，则会出现交叉反应（cross reaction）。,比例性（proportionality）比例性指抗原与抗体发生可见反应需要合适的量比关系，只有当二者浓度比例适当，才能形成较大的抗原抗体结合物。把最迅速出现可见反应时的抗原抗体浓度比或量比称为抗原抗体反应的最适比（optimal ratio）或称等价比（equivalence point）。,因抗原抗体比例不合适而不出现可见反应，称带现象（zone phenomenon）。抗体
4、过量时称为前带（prozone）。抗原过量时称为后带（postzone）。当抗原或抗体为单价，不管抗原与抗体的量比关系是否合适，均不能出现可见反应现象。,抗原抗体结合的比例性（带现象）,可逆性抗原抗体复合物解离取决于抗体对相应抗原的亲和力和环境因素对复合物的影响。亲和性（affinity）是抗体分子上一个抗原结合部分与对应抗原决定簇之间的相适性而存在的引力，是抗原与抗体间固有的结合力。亲和力（avidity）指反应系统中复杂抗原与相应抗体之间的结合能力。,亲和力与亲和性有关，也与抗体的结合价和抗原有效决定簇数目有关。IgG为2价，其亲和力为单价的102倍；而IgM为10价，其亲和力为单价的10
5、6倍。亲和力越大，抗原抗体结合越牢固。,抗体与抗原结合是可逆反应，高亲和性抗体的抗原结合点与抗原表位在空间构型上非常合适，两者结合牢固；低亲和性抗体与抗原形成的复合物较易解离，解离后的抗原或抗体均能保持未结合前的结构、活性及特异性。,第三节 影响抗原抗体反应的因素,反应物自身因素抗原抗原的理化性质、抗原决定簇数目和种类均可影响抗原抗体反应的结果。抗体不同动物免疫血清反应性有差异特异性和亲和力共同影响实验结果的准确程度抗体的浓度,环境条件电解质抗原抗体结合后由亲水胶体变为疏水胶体，易受电解质影响。若无电解质存在，则不出现可见反应。但如果电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀，即盐析。,酸碱度
6、pH过高或过低都可影响抗原和抗体的理化性质。抗原抗体反应一般以pH69为宜。温度抗原抗体反应最适温度为37有些特殊抗原抗体反应需要特定温度，如冷凝集在4时与红细胞结合，20以上反而解离。此外适当振荡与搅拌，可促进抗原抗体分子的结出，加速反应。,第四节 抗原抗体反应的类型,凝集反应（agglutination reaction）,凝集反应是指细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面覆盖抗原（或抗体）的颗粒状物质（如红细胞、聚苯乙烯乳胶等）与相应抗体（或抗原）结合，在一定条件下形成肉眼可见的凝集团块现象。,凝集实验是一个定性检测方法，即根据凝集现象的出现与否判定结果阳性与阴性。也可以进行半定量检测，即将标本
7、作一系列对倍稀释后进行反应，以出现阳性反应的最高稀释度作为滴度。,凝集反应的类型,直接凝集反应颗粒性抗原在适当电解质参与下，直接与相应抗体结合出现肉眼可见的凝集现象，成为直接凝集实验（direct agglutination test）。反应中的抗原称为凝集原（agglutinogen）。参与反应的抗体称为凝集素（agglutinin）。,玻片凝集实验为定性实验方法主要用于菌种鉴定和血清型分型，也用于人类红细胞ABO血型鉴定。试管凝集实验为半定量实验方法通常以产生明显凝集现象的最高稀释度管作为血清抗体的效价，亦称为滴度。,间接凝集反应用人工方法将可溶性抗原（或抗体）先吸附或偶联于与免疫无关的颗
8、粒性载体表面，再与相应抗体（或抗原）作用，在有适宜电解质存在时即可发生凝集，称为间接凝集反应。,间接凝集反应中所用与免疫无关的颗粒称为载体（carrier）。将抗原（或抗体）吸附或偶联于颗粒表面的过程称为致敏（sensitization）。吸附有已知抗原（或抗体）的颗粒称为致敏颗粒（sensitized particle）。敏感度比直接凝集反应高28倍，适用于各种可溶性抗原（或抗体）的检测，敏感度也高于沉淀反应。,间接凝集反应类型正向间接凝集反应：用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。反向间接凝集反应：用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原。间接凝集抑制反应：通过抗原致敏的颗粒载体及相应抗
9、体的反应来判断检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。,协同凝集反应（coagglutination）：协同凝集反应与间接凝集反应的原理类似，但所用载体为金黄色葡萄球菌。多数金黄色葡萄球菌的细胞壁内有一种特殊的蛋白质，葡萄球菌A蛋白质（staphylococcal protein A）。SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG类抗体的Fc段非特异性结合。可用于微生物的快速诊断、定种及定型，以协助传染病的早期诊断。,间接凝集反应的载体如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红细胞、某种细菌等。良好的载体应符合以下基本条件在生理盐水或缓冲液无自凝倾向大小均匀比重与介质相似，短时间内不能沉淀无化
10、学或血清学活性吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性,目前应用最广的是人O型红细胞和绵羊红细胞。后者应用更广，因为其来源方便，另外，绵羊红细胞的表面有大量糖蛋白受体，极易吸附某种抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致 。,间接凝集反应的应用检测抗原：反向间接凝集实验可用于检测病原体的可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。检测抗体：可用于检测细菌、病毒、寄生虫等感染后产生的抗体，也可用于检测自身免疫性疾病的抗体。,自身红细胞凝集实验自身红细胞凝集实验（autologous red cell agglutination）与一般间接凝集实验不同之处为，反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂
11、为抗人O型红细胞的单克隆抗体，这种抗体能与任何血型的红细胞结合，但不引起凝集反应。,这种抗体与另一特异性抗体连接成的双功能抗体可用于检测标本中的抗原；如与特异性抗原连接，则可用于检测标本中的抗体。反应中的标本为检测者的全血。,自身红细胞凝集实验的特点受检标本为全血。不需要分离血清，采指血或耳垂血进行实验受检者即刻可知检测结果,沉淀反应（precipitation reaction）,沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生结合而出现沉淀的现象。根据介质和检测方法不同，沉淀反应可分为液相沉淀实验、凝胶沉淀实验和凝胶免疫电泳技术等三大基本类型。,液相内沉淀反应指以含盐缓冲液为反应介质的抗原
12、抗体特异性结合的沉淀反应。絮状沉淀实验（flocculation）环状沉淀实验（ring precipitation）将抗原溶液叠加在细小玻管中抗体溶液上面，因抗血清蛋白浓度高，比重大，在两液交界的清晰界面上形成白色沉淀环为阳性反应。,免疫浊度实验（immunoturbidimetry），20世纪70年代出现的微量免疫沉淀测定法透射比浊法散射比浊法免疫乳胶比浊法,凝胶内沉淀实验（gel phase precipitation）主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝胶。根据抗原与抗体反应的方式和特性，可将凝胶内沉淀实验分为单向琼脂扩散实验和双向琼脂扩散实验
13、。,单向琼脂扩散实验将定量抗体混匀在琼脂凝胶中，加待测抗原溶液使其单独在凝胶中扩散，在抗原抗体相遇比例合适的部位，两者结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度成正相关。该方法简便，易观察结果，常用于测定人或动物血清。缺点是需12天才能看结果。,单向琼脂扩散实验,双向琼脂扩散实验将抗原和抗体溶液分别放在凝胶不同的对应孔中，让两者均在凝胶中自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。常用于抗原或抗体的定性或定量测量，还可用于两种抗原材料的抗原相关性分析。,免疫电泳技术免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。两大优点加快了沉淀反应的速度将某些蛋白组分根据其所带电荷不同而分开后，再
14、与抗体起反应，使本法更微量化和多样化。,免疫电泳（immuno electrophoresis，IEP）免疫电泳时先用区带电泳技术将蛋白质抗原按其所带电荷、分子量和构型的不同，在凝胶电泳中分成不同区带；再与电泳方向平行，挖一条型槽，加入相应抗血清，置室温或37，使抗原和抗体呈双相扩散而在相应位置上形成肉眼可见的弧形沉淀线。根据沉淀弧的数量、位置和形态，可分析样品中所含抗原的成分及性质。用于分析血清蛋白种类，对免疫球蛋白缺损或增多的疾病的诊断或鉴别诊断有重要意义。,免疫电泳（图1）,免疫电泳（图2）,免疫电泳（图3）,免疫电泳（图4）,免疫电泳（图5）,免疫电泳,火箭免疫电泳（rocket im
15、muno electrophoresis，RIE）火箭免疫电泳技术是把抗原置于含有抗体的凝胶内电泳。在电场作用下，抗原与凝胶中的抗体移动，逐渐形成梯度浓度，在抗原抗体比例适当时形成不溶性免疫复合物而沉淀。随着抗原量减少，沉淀带越来越窄，形成火箭峰样沉淀带，峰形高低与抗原量成正比。主要用于抗原或抗体的定量分析，比单向琼脂扩散实验节约了反应时间。,火箭免疫电泳,对流免疫电泳（counter immuno electrophoresis，CIEP）对流免疫电泳是定向加速的电泳技术与免疫双向扩散技术结合。在pH8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白因等电点高、带微弱负电荷且分子量较大，电泳力会小于电渗力，泳向负极；而一般的抗原蛋白常带较强负电荷且分子较小，造成电泳力大，泳向正极。,电泳时，抗原放负极侧孔，抗体放正极侧孔，抗原抗体相对泳动，在两孔间相遇，在比例合适处形成肉眼可见的沉淀线。若抗原浓度超过抗体，沉淀线靠近抗体孔。若抗体浓度超过抗原，沉淀线靠近抗原孔。,对流免疫电泳,小结,凝集反应方法简便，反应快，无需特殊实验设备，费用低。沉淀反应虽方法简便，费用低廉，但因其反应灵敏度低于使用标记技术的实验，自动化程度亦低，已较少应用。,Next Lecture,免疫标记技术,
