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1、大肠杆菌感受态细胞的制备与转化,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,1,大肠杆菌感受态细胞的制备与转化 大肠杆菌感受态细胞的置备与,一. 实验目的 通过本实验，学习大肠杆菌感受态细胞制备和转化的原理与技术方法。,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,2,一. 实验目的大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化2,二. 实验原理感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能使许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,3,二. 实验原理大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化3
2、,转化（transformation）： 是将异源DNA分子引入受体细胞，使其获得新的遗传性状的一种技术方法。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,4,转化（transformation）：大肠杆菌感受态细胞的置,大肠杆菌转化的方法：化学法：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞；电转化法：通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,5,大肠杆菌转化的方法：大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化5,转化子的筛选：利用导入的
3、DNA上的选择性标记，区分转化子与非转化子。选择性标记主要有两类：营养筛选标记抗性筛选标记,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,6,转化子的筛选：大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化6,三实验方法,1挑取大肠杆菌DH5单菌落，接于5mL LB液体培养基中37振荡培养过夜2以1:50比例将1ml菌液转移到新鲜LB液体培养基中，37振荡培养1.52 hr左右，使A600在0.40.5左右,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,7,三实验方法 1挑取大肠杆菌DH5单菌落，接于5mL L,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,8,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化8,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,9,
4、大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化9,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,10,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化10,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,11,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化11,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,12,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化12,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,13,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化13,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,14,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化14,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,15,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化15,3将培养液4ml转移到5ml离心管中，4，2000g离心3min4弃上
5、清，加0.5mL用冰预冷的0.1 M CaCl2溶液，轻轻吹打或摇动混匀细胞注意：加入CaCl2动作需轻柔，勿剧烈震荡，并且尽量使细胞处于低温中,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,16,3将培养液4ml转移到5ml离心管中，4，2000g离心,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,17,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化17,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,18,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化18,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,19,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化19,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,20,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化20,大肠杆菌感受态细胞的置备与
6、质粒转化,21,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化21,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,22,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化22,5冰上放置20min，2000g离心2min 6弃上清，加0.1ml预冷的 0.1 M CaCl2溶液，轻轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞注意：离心后观察沉淀，如果出现中间空心的沉淀说明操作正常,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,23,5冰上放置20min，2000g离心2min 大肠杆菌感受,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,24,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化24,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,25,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化2
7、5,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,26,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化26,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,27,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化27,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,28,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化28,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,29,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化29,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,30,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化30,7将取0.1ml感受态细胞转移到1.5ml离心管中，加2l 质粒，混匀，冰上放置30min842水浴90秒,在冰上放置2min9加入 0.5 ml新鲜LB培养基，37，200rpm振荡约
8、30min45min（注：转纯质粒可省略，转连接产物需进行）10. 取 100l 涂布到含有氨苄青霉素的平板上,加X-gal/IPTG各3L 11倒置平皿，37培养1216h,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,31,7将取0.1ml感受态细胞转移到1.5ml离心管中，加2,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,32,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化32,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,33,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化33,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,34,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化34,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,35,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化3
9、5,每个平板大约20ml的培养基,平板培养基,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,36,每个平板大约20ml的培养基平板培养基大肠杆菌感受态细胞的置,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,37,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化37,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,38,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化38,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,39,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化39,用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。,大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化,40,用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DN,
