大肠杆菌表达体系介绍课件.ppt

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1、表达系统背景工业酶,应用： 洗涤酶、纺织酶、饲料酶、果汁酶、烘焙酶、酿造酶,工业酶与我们的日常生活息息相关。,1,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,表达系统背景应用： 工业酶与我们的日常生活息息相关。1大,市场,摘自novozymes 2012年报,（1）市场容量小-全球市场约250-300亿元人民币,（2）产能大、价低、技术密集型,2,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,市场摘自novozymes 2012年报（2）产能大,市场需求：纺织酶,从全球来看，纺织酶大概占酶制剂行业10%左右，规模在2.5亿元美金，中国市场目前市场规模在6个亿左右，但主要为外资占据，国内企业基本处于竞

2、争弱势，但国内市场将会维持持续高增长。,纤维素酶：尤特尔、夏盛、江西博兰、高宝、康地恩（蔚蓝），中温淀粉酶：江阴百圣龙、杰诺、其他淀粉酶公司除氧酶：无，几家企业在产业化开发中（江南大学的技术）碱性果胶酶：无，几家企业在产业化开发中（江南大学的技术）,典型企业：,目前市场增长：15%左右,市场预期,市场格局,3,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,市场需求：纺织酶从全球来看，纺织酶大概占酶制剂行业10%左右,纺织酶主要品种市场预期及发展现状,4,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,纺织酶主要品种市场预期及发展现状品种功能使用条件最优使用条件,市场需求：动物饲料酶,从长远来看，饲料仍然

3、有较大的市场发展空间，其将在一定时间内保持较高增长。而从目前产品结构来看，植酸酶在饲料市场占有较高的份额。,广东溢多利我国最大的动物饲料酶公司北京昕大洋植酸酶生产及制剂挑战集团植酸酶的龙头企业，及动物饲料和饲料添加剂其他：康地恩、新华扬、夏盛等公司,典型企业：,市场产品结构,市场空间（吨）,5,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,市场需求：动物饲料酶 从长远来看，饲料仍然有较大的市场发展空,动物饲料酶,6,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,品种功能使用条件最优使用条件产业化情况预期市场植酸酶降解饲料,市场需求：其它领域,中国在洗涤剂用酶行业发展一直较为缓慢。主要是与特定的洗涤方式

4、和洗涤剂的形式决定的。如洗涤剂主要还是以粉状为主，液体较少，而事实上液体洗涤剂中酶的加入更容易，更普遍，且更易洗涤。此外，中国更多是冷水洗涤，20oC左右，而欧美的洗涤温度30-40oC。而国内当前低温洗涤用酶的开发很少。因而洗涤用酶市场需求并未得到有效激发,洗涤用酶,淀粉深加工酶,食品用酶,其它用酶:如新能源、皮革、造纸等领域,在淀粉加工行业，酶作为重要的必要的催化剂，其需求将保持持续稳定，如糖化酶：市场稳定，供过于求；淀粉酶：高品质酶有需求，需求稳定；葡萄糖异构酶：市场需求稳定；普鲁兰酶：市场需求稳定,酶在其它新兴领域，如新能源等领域有着潜在的市场需求，目前一些企业正在开发。但基本都处在研

5、发阶段，如DSM、诺维信、杰能科；DSM：美国市场（中试乙醇厂），纤维素酶+辅酶 化学工艺相结合；诺维信：国内与中粮战略合作，中试工厂；杰能科+Dupont：合作生产纤维素乙醇。国内一些厂家也在开发试验，如中科院过程所、中科院微生物所、天津工生所、山东大学等其它领域，如皮革、造纸等领域也正逐渐兴起。,随着食品工业与酶制剂行业的发展，特别是绿色、高质量食品将对酶制剂表现出持续的需求，如糖化酶、淀粉酶、低聚糖等在果汁加工、酿造、肉类处理、啤酒等行业有着广泛的需求。,7,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,市场需求：其它领域 中国在洗涤剂用酶行业发展一直较为缓慢,常用微生物表达系统,8,大肠杆

6、菌表达体系介绍,10/2/2022,常用微生物表达系统类型菌株原核Escherichia col,表达系统,工业生产：菌株、发酵工艺和后提取方法等,菌株：诱变选育高产菌和基因工程菌,9,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,表达系统工业生产：菌株、发酵工艺和后提取方法等摘自Mic,工业酶表达系统特点：,酶蛋白高效表达系统：是酶制剂开发和应用最关键的技术,工业化应用的表达系统评价的四个指标,10,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,工业酶表达系统特点：酶蛋白高效表达系统：是酶制剂开发和应用最,常用工业酶表达系统的表达水平,11,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,常用工业酶表达系

7、统的表达水平种类菌名表达水平举例目的蛋白总蛋,大肠杆菌蛋白表达系统枯草芽孢杆菌蛋白表达系统酵母蛋白表达系统丝状真菌蛋白表达系统,12,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,大肠杆菌蛋白表达系统12大肠杆菌表达体系介绍10/2/202,外源基因在大肠杆菌中的表达,13,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,外源基因在大肠杆菌中的表达13大肠杆菌表达体系介绍10/2/,外源基因在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安

8、全的基因工程受体生物,14,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特,外源基因在大肠杆菌中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素,15,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数,转录水

9、平,翻译水平,16,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,P tac = 3 P trp = 11 P lac,启动子,17,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,P tac = 3 P trp = 11 P lac启动子-,转录调控机理 具有多顺反子结构，基因排列次序为： 启动子（lacP）- 操纵基因（lacO） - 结构基因（lacZ-lacY-lacA） 正调节因子 CAP 负调节因子 lac I,启动子,Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统,18,大肠杆菌表达体系介绍,10

10、/2/2022,启动子Lac 表达系统18大肠杆菌表达体系介绍10/2/20,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,高效转录,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,基底水平转录,Lac 表达系统 正调节因子 CAP cAMP激活CAP，CAPcAMP复合物与 lac 操纵子上专一位点结合 后，能促进 RNA 聚合酶与 35、10 序列的结合，进而促进 Plac 介导的转录。,基因工程中使用的 lac 启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即 Plac UV5,19,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,lacI Plac,Lac 表达系统 lac

11、UV5 突变体 Plac UV5 突变体能够在没有 CAP 存在的情形下非常有效的起始 转录，受它控制的基因在转录水平上只受 lacI 的调控，因此用它 构建的表达载体在使用时比野生型 Plac 更易操作。,20,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,Lac 表达系统20大肠杆菌表达体系介绍10/2/2022,Lac 表达系统 负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动 子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA,基底水平转录,lacI Plac lacO lacZ lacY lacA

12、,高效转录,mRNA,21,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,Lac 表达系统 lacI P,Tac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 35 序列和 lacUV5 的 10 序列拼接而成的杂 合启动子。 调控模式与 lacUV5 相似，但 mRNA 转录水平更高于 trp 和 lacUV5 启动子（P tac = 3 P trp = 11 P lac），因此在要求有较高基因表达 水平的情况下，选用 tac 启动子比用 lacUV5 启动子更优越。,22,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,Tac 表达系统启动子-35 区序列-10 区序列,lac、tac 启动子对宿主菌的

13、要求 在普通大肠杆菌中， LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 操纵子 转录调控的需要。 当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入 大肠杆菌后，LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降，无法保证每一 个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控。表现为在无诱 导物存在的情形下， lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录。,23,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,lac、tac 启动子对宿主菌的要求23大肠杆菌表达体系介绍,lac、tac 启动子对宿主菌的要求 为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因

14、转录的能力，一 种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表 达系统。 大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq ，常被选用为 Lac、Tac 表达系统的宿主菌。 但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷 贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。 需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生。,24,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,lac、tac 启动子对宿主菌的要求24大肠杆菌表达体系介绍,lac、tac 表达系统存在的问题 IPTG 用于诱导 lac、tac 启动子

15、的转录，但由于 IPTG 本身具有一定的 毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。 一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用 IPTG 解决方法 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录,25,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,lac、tac 表达系统存在的问题 25大肠杆菌表达体系介绍,lac、tac 表达系统存在的问题 lac 和 tac 启动子的转录受温度严紧调控 把阻遏蛋白 LacI 的温度敏感突变体lacI(ts)、lacIq(ts)插入表达载体或 整合到染色体后，均能使 la

16、c 和 tac 启动子的转录受到温度严紧调控 在较低温度（30）时抑制，在较高温度（42）时开放。 用乳糖替代 IPTG 诱导 lac 和 tac 启动子的转录 乳糖在 b-半乳糖苷酶作用下生成异乳糖，异乳糖具有诱导剂的作用 这一过程涉及乳糖的转运和转化，其效率受到多种因素的影响和制约 因此乳糖诱导的有效剂量大大高于IPTG。 乳糖本身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也 会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖替代 lPTG 作为诱导剂的研究 要与发酵工艺结合起来，才能显示其良好的前景。,26,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,lac、tac 表达系统存在的问题 26大肠杆

17、菌表达体系介绍,转录调控机理 色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。 在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， 便可有 效地解除阻遏抑制作用。 在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中 往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的目的基因表达,启动子,Trp 表达系统 以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统,27,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,启动子Trp 表达系统27大肠杆菌表达体系介绍10/2/20,Trp 表达系统,基底水平转录,在有高浓度Trp存在时,阻遏蛋白trpR- 色氨酸复合物形成

18、一个同源二聚体, 并且与色氨酸操纵子紧密结合,因此可以阻止转录,28,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,Trp 表达系统,PL 和 PR 表达系统 以 l 噬菌体早期转录启动子 PL 、 PR 为核心构建的表达系统 在野生型 l 噬菌体中， PL 、 PR 启动子转录与否决定了 l 噬菌体进入 裂解循环还是溶源循环。,启动子,29,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,PL 和 PR 表达系统启动子29大肠杆菌表达体系介绍10/,PL 和 PR 表达系统 转录调控的机理 由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的 阻遏物。cI 基因的产物在

19、大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。 因此 PL 、 PR 表达系统都选用温度敏感突变体 cI 857(ts) 的基因产物 来调控 PL 、 PR 启动子的转录。 在较低温度（30）时以活性形式存在 在较高温度（42）时失活脱落,30,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,PL 和 PR 表达系统30大肠杆菌表达体系介绍10/2/2,PL 和 PR 表达系统 宿主菌中没有 cI 基因产物，PL、PR 启动子的高强度直接转录，带有PL 或 PR 启动子的表达载体在普通大肠杆菌中很不稳定。 对

20、宿主菌的要求 用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌 N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大,31,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,PL 和 PR 表达系统31大肠杆菌表达体系介绍10/2/2,PL 和 PR 表达系统存在的问题 由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几 个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统。 缺陷 在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋

21、白的表达也会被激活，其 中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。 在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30 提高到 42 需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效 果，对重组蛋白表达量有一定的影响。,32,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,PL 和 PR 表达系统存在的问题32大肠杆菌表达体系介绍1,T7 表达系统 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。,33,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,T7 表达系统33大肠杆菌表达体系介绍10/2/2022,T7 表达系统 T

22、7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。 T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。 在细胞中存在 T7 RNA聚合酶和 T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆 菌宿主本身基因的转录竞争不过 T7 噬菌体转录体系，最终受 T7噬 菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。,34,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,T7 表达系统34大肠杆菌表达体系介绍10/2/202,T7 表达系统 转录调控的机理 T7 噬菌体启动子的转录完全依赖于

23、T7 RNA 聚合酶，因此 T7 RNA 聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。 化学诱导型 温度诱导型 双质粒系统,35,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,T7 表达系统T7 RNAT7 启动子,T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。,T7 RNA 聚合酶基因,lac 启动子,E.Coli （DE3）,IPTG诱导,

24、36,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,T7 表达系统 T7 RNA 聚合酶基因 lac 启动,T7 表达系统 转录调控的机理 温度诱导型 PL 启动子控制 T7 RNA 聚合 酶基因，通过热诱导方式激发 T7 噬菌体启动子的转录。 这种方式可以使本底转录降到 很低的水平，尤其适用于表达 对大肠杆菌宿主有毒性的重组 蛋白质。,T7 RNA 聚合酶基因,PL 启动子,E.Coli （CE6）,热诱导,cI857,37,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,T7 表达系统 T7 RNA 聚合酶基因 PL 启动子,T7 表达系统 转录调控的机理 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA 聚

25、合酶 基因，另一个质粒带有 T7 启 动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标记 不能相同 调控方式为控制 T7 RNA 聚合 酶的启动子调控类型,热诱导,38,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,T7 表达系统T7 RNA热诱导T7 启动子,T7 表达系统存在的问题 T7 表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的，但 也不可避免出现在相对较高的本底转录，如果目的基因产物对大肠杆 菌宿主有毒性，会影响细胞的生长。 解决办法之一 在表达系统中低水平表达 T7 溶菌酶基因。 因为 T7 溶菌酶除了作用于大肠杆菌细胞壁上肽聚糖外，还能与 T7 RNA 聚合酶结合抑制其转录的活性。

26、目前 T7 溶菌酶基因都通过共转化质粒导入表达系统，它能明显 降低本底转录，但对诱导后目的基因的表达水平无明显影响。,39,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,T7 表达系统存在的问题39大肠杆菌表达体系介绍10/2/2,营养调控型 采用大肠杆菌碱性磷酸酯酶基因 phoA 启动子或甘油 3-磷酸转移系 统 ugp 启动子构建表达载体。 这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi5mmol/L 时抑制，Pi1mmol/L 时激活)，具有较高的转录水平。,其他表达系统,40,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,营养调控型其他表达系统40大肠杆菌表达体系介绍10,糖原调控型

27、采用的有大肠杆菌半乳糖转移系统（mglBAEC) mgl 启动子或沙门 氏菌阿拉伯糖基因 araB 启动子构建表达载体。 这两个启动子受葡萄糖抑制，岩藻糖和阿拉伯糖是它们的诱导物。 其调控机理类似于 Lac 表达系统.,其他表达系统,41,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,糖原调控型其他表达系统41大肠杆菌表达体系介绍10/2,H调控型 采用大肠杆菌赖氨酸脱羧酶基因 cadA 启动子构建表达载体。 cadA 启动子受培养基中 H+ 浓度，即 pH 值调控。（在pH8 时抑 制，pH 6时激活，pH = 6时转录活力最高）。 该表达系统要求菌体发酵温度控制在 27 30 之间才能使目的基

28、 因得到稳定的表达.,其他表达系统,42,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,H调控型其他表达系统42大肠杆菌表达体系介绍1,强化转录终止的必要性 外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物，过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下： 转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源基 因本身的转录效率下降； 如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标 记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录

29、可能干扰质粒的复制及其 它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构， 从而大大降低外 源基因编码产物的翻译效率,终止子,43,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,强化转录终止的必要性终止子43大肠杆菌表达体系介绍10/2/,强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上 的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。,终止子,对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录

30、终止作用,44,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,强终止子的选择与使用终止子 对于一些终止作用较弱的终止子，通,核糖体结合位点 外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关。 大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）,核糖体结合位点,45,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,核糖体结合位点核糖体结合位点45大肠杆菌表达体系介绍10/2,核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点

31、包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的 68 个核苷酸序列 5 UAAGGAGG 3 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚 基中的 16S rRNA 3 端区域 3 AUUCCUCC 5 并与之专一性结合 将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的 起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5 端若干密码子的碱基序列,核糖体结合位点,46,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,核糖体结合位点核糖体

32、结合位点46大肠杆菌表达体系介绍10/2,核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列的影响 一般来说，mRNA 与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就 越高，而这种结合程度主要取决于 SD （ UAAGGAGG）序列与 16S rRNA 的碱基互补性，其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。 对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成 C 或 T，均会导 致翻译效率大幅度降低,核糖体结合位点,47,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点47大肠杆菌,核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列与起始密码子之间的序列的影响 SD 序列下

33、游的碱基若为 AAAA 或 UUUU，翻译效率最高；而 CCCC 或 GGGG 的翻译效率则分别是最高值的 50% 和 25%。 紧邻 AUG 的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。 对于大肠杆菌 b-半乳糖苷酶的 mRNA 而言，在这个位置上最佳 的碱基组合是 UAU 或 CUU，如果用 UUC、UCA 或 AGG 取代 之，则酶的表达水平低 20 倍,核糖体结合位点,48,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点48大肠杆菌,核糖体结合位点对外源基因表达的影响 SD 序列与起始密码子之间的距离的影响 SD 序列与起始密码子 AUG 之间的精确

34、距离保证了 mRNA 在 核糖体上定位后，翻译起始密码子 AUG 正好处于核糖体复合物 结构中的 P 位，这是翻译启动的前提条件。 在很多情况下，SD 序列位于 AUG 之前大约七个碱基处，在此 间隔中少一个碱基或多一个碱基， 均会导致翻译起始效率不同 程度的降低,核糖体结合位点,49,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点49大肠杆菌,核糖体结合位点对外源基因表达的影响 起始密码子及其后续若干密码子的影响 大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG、GUG 和 UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG 为 AUG

35、 的 50%，而 UUG 只及 AUG 的 25%。 除此之外，从 AUG 开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至 少这一序列不能与 mRNA 的 5 端非编码区形成茎环结构，否则便 会严重干扰 mRNA 在核糖体上的准确定位 目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与 启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。,核糖体结合位点,50,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,核糖体结合位点对外源基因表达的影响核糖体结合位点50大肠杆菌,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：生物基因组中的碱基含

36、量 在富含 AT 的生物（如单链 DNA噬菌体X174）基因组中，密码子 第三位上的 U 和 A 出现的频率较高； 在 GC 丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有 G 或 C 的 简并密码子占 90% 以上的绝对优势密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律 如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU 等使用少 如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG 等使用多细胞内 tRNA 的含量,密码子,生物体对密码子的偏爱性,51,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，,密码子,密码子偏爱性对

37、外源基因表达的影响 由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。 一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达： 外源基因全合成 同步表达相关 tRNA 编码基因,52,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,密码子密码子偏爱性对外源基因表达的影响52大肠杆菌表达体系介,质粒拷贝数,质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响 目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理

38、代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降 解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道,53,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响53大肠杆菌表达体系,外源基因在大肠杆菌中的表达,蛋白质的合成是在细胞中进行的 目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细胞总蛋白的 20%40%。 目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体

39、存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借助于本身的 功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最终分泌到周质空 间，或分泌到培养液中。,54,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,外源基因在大肠杆菌中的表达蛋白质的合成是在细,大肠杆菌基因工程菌的构建策略 包涵体型异源蛋白的表达 分泌型异源蛋白的表达 融合型异源蛋白的表达 寡聚型异源蛋白的表达 整合型异源蛋白的表达 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,55,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,大肠杆菌基因工程菌的构建策略外源基因在大肠杆菌中的表达55大

40、,包涵体及其性质 在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，异源蛋白质在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。 除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子,包涵体型异源蛋白的表达,56,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,包涵体及其性质包涵体型异源蛋白的表达56大肠杆菌表达体系介绍,以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的优点 在一定程度上保持

41、表达产物的结构稳定 能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集 简化外源基因表达产物的分离操作 包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌 体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细 菌裂解物中分离出来 能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白,包涵体型异源蛋白的表达,57,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体型异源蛋白的表达57大,以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点 包涵体表达形式的缺点 以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过 有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具 有

42、生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标 产物的收率至关重要。 经过复性处理的目标蛋白不一定能完全恢复原来的生物学活性， 有时甚至完全得不到有活性的蛋白质，尤其当目标蛋白分子中的 Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低， 一般不 超过 30% 复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。,包涵体型异源蛋白的表达,58,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点包涵体型异源蛋白的表达58大,包涵体的变性与复性操作 包涵体的溶解与变性 包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键。在 人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。 能

43、有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括： 清 洗 剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价， 但影响复性和纯化 促 溶 剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜， 但常被自发 形成的氰酸盐污染， 后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用， 溶解力增强 极 端 pH 廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应,包涵体型异源蛋白的表达,59,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,包涵体的变性与复性操作包涵体型异源蛋白的表达59大肠杆菌表达,包涵体的变性与复性操作 包涵体的复性与重折叠（refolding） 包涵体的复性与重折叠的主要任务： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折

44、叠 通过次级键的形成使蛋白质复性,包涵体型异源蛋白的表达,60,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,包涵体的变性与复性操作包涵体型异源蛋白的表达60大肠杆菌表达,在细胞内表现为可溶性的蛋白质 目标蛋白以可溶性蛋白质形式表达虽然可以避免包涵体复性带来的问题，但是也有一定的缺陷，主要表现为大肠杆菌本身存在于细胞质中的蛋白质往往只含有少量的，甚至没有半胱氨酸残基。富含半胱氨酸残基，需要形成二硫键的蛋白质大部分被转运到细胞的其他部位。,分泌型异源蛋白的表达,61,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,在细胞内表现为可溶性的蛋白质分泌型异源蛋白的表达61大肠杆菌,这是因为大肠杆菌细胞质微环境的

45、氧化还原态势不利于蛋白质二硫键的形成，而且缺少一种形成二硫键所必须的体系。一些需要通过二硫键的形成来维持其构象的目标蛋白在大肠杆菌的细胞质中往往不能正确折叠。 解决这一问题的途径之一是用大肠杆菌氧硫还蛋白还原酶基因 trxB 缺陷株作为宿主菌表达目标蛋白。研究表明trxB 缺陷株细胞质的氧化还原态势发生了变化，蛋白质在 trxB 缺陷株的细胞质中能够形成二硫键。这一菌株对于表达结构复杂的蛋白质而言是一个相当重要的工具。,分泌型异源蛋白的表达,62,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,这是因为大肠杆菌细胞质微环境的氧化还原态势不,目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达 与纯化包涵体相比，细胞质

46、中以可溶性形式表达蛋白质的分离纯化过程比较复杂，一般要通过亲合层析才能达到比较高的纯度。 目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达既可以提高分离纯化的效率，又能在融合蛋白切离的过程中得到没有附加甲硫氨酸目标蛋白。 金黄色葡萄球菌蛋白G、A和衍生物Z，谷胱甘肽-S-转移酶（GST），大肠杆菌麦芽糖结合蛋白MBP，His-tag 等是目前常用的与目标基因融合表达的序列。,63,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,目标蛋白与有亲合配基的序列融合表达63大肠杆菌表达体系介绍1,GST,64,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,GST64大肠杆菌表达体系介绍10/2/2022,目标蛋白在周质空间中

47、表达目标蛋白在周质空间中表达的优点 大肠杆菌周质空间中自身蛋白质的数量约为 100 种，只占菌体总蛋白数量的4%。蛋白水解酶的含最与在细胞质中相比也少得多，因此目标蛋白在周质空间中表达有利于分离纯化和减少蛋白水解酶的降解。 目标蛋白从细胞质转运到周质空间过程中信号肽被加工切除，有效地避免了N 端附加的甲硫氨酸的产生。 周质空间中呈氧化型的氧化还原态势使目标蛋白能够较好折叠，维持正确的构象。,65,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,目标蛋白在周质空间中表达65大肠杆菌表达体系介绍10/2/2,目标蛋白分泌表达 把所表达的目标蛋白分泌到细胞外的培养基中可以进一步减少蛋白水解酶的降解，也有利

48、于分离纯化。 目前成功的例子主要是采用以下方案: （1）与大肠杆菌本身的分泌蛋白基因融合表达 （2）与一些能提高细胞外膜通透性的因子融合或共表达 （3）改变培养基的成分 归纳现有的研究结果显示这些方法仅对分泌分子量较小的蛋白有效，而且分泌效率一般都比较低。,66,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,目标蛋白分泌表达66大肠杆菌表达体系介绍10/2/2022,高效表达目标基因的战略和技术,表达质粒的优化和设计共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因提高目标基因 mRNA 和目标基因产物的稳定性高密度发酵和工程化宿主细胞,67,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,高效表达目标基因的战略

49、和技术表达质粒的优化和设计67大肠杆,高效表达目标基因的战略和技术,表达质粒的优化和设计 构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码 ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。 核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表现为： SD 序列 UAAGGAGG 的翻译效率要比 AAGGA 高36倍 翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是 68 个碱基长度， 与 AAGAA 的最适距离是57 个碱基长度 ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3 4个碱基，与 AAGAA 至少相隔 5 个碱基； mRNA 的翻译才能进行 ATG 与

50、 SD 序列之间的碱基组成为 A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效 率较高。,68,大肠杆菌表达体系介绍,10/2/2022,高效表达目标基因的战略和技术表达质粒的优化和设计68大肠杆,核糖体结合位点本身和附近的序列决定了目标基因 mRNA 5 端的二级结构，研究表明 mRNA 5端形成的 “茎环” 结构阻碍了 mRNA 与核糖体 30S 亚基的结合，从而抑制了翻译的起始。 尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中 A/T 碱基的含量，降低 mRNA 5 端形成的 “茎环” 结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。 在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR 等技术改变个别关键的碱基来破