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1、Chapter 5色谱技术Chromatography,通过本章学习应能够回答以下问题,什么是色谱分离技术？色谱分离技术的分类？什么是色谱柱的理论塔板数以及如何计算理论塔板数？什么是吸附色谱及其分类和基本原理？什么是分配色谱？,离子交换色谱的分类及应用凝胶色谱的分离原理及分类离子交换及疏水作用层析的原理高效液相色谱的分离原理及应用？蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？共价色谱的工作原理？,5.1色谱（Chromatography）分离技术的分类及一般原理,5.1.1概念、分类和原理1、概述 1903年，俄国植物学家茨维特用菊根粉柱和碳酸钙柱分离和研究植物色素的提取物时，用石油醚提取和过柱后，在柱上
2、得到黄色和绿色的区带，这便是色谱技术概念的最初来源，色谱分离概念从此一直沿用至今。,俄国植物学家茨维特在1903年使用的色谱原型装置如图。,2、什么是色谱技术（分配色谱）,概念：色谱分离技术是利用混合液中各种组分之间的理化性质差别，在固定相和流动相中具有不同的平衡分配系数（或溶解度），当两相作相对运动时，不同的组分在两相中被反复多次地分配，形成特有的区段，从而得到分离。,色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,其中的一相固定不动，称为固定相；另一
3、相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。,当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础。,简单的说，色谱技术是在特定的色谱柱当中，利用不同物质与固定相的亲和力差异而实现分离的一组技术。其优点是分辨率高，是生化产品纯化、分析的重要手段，这一切均源于其特殊的分离模
4、式，即塔板理论,3、色谱分离方法的分类,按机理分，常用于生物大分子分离的色谱方法有以下几种：（1）、吸附色谱:利用样品组分在吸附剂上的吸附系数或吸附能力差别而分离；（2）、分配色谱：利用样品组分在固定相与流动相中的溶解度不同，所造成的分配系数差别而分离；,（3）、离子交换色谱：利用样品离子与固定相的可交换离子的交换能力或交换系数的差别而分离；（4）、凝胶色谱：利用样品的分子大小与凝胶的孔径间的关系即渗透系数差别而分离；,根据两相所处状态: 液相色谱和气相色谱；根据操作方法: TLC（薄层色谱）、柱色谱 与纸色谱等,色谱分离过程的特点,（1）应用范围广。从极性到非极性、离子型到非离子型、小分子到
5、大分子、无机到有机以及生物活性物质、热稳定到热不稳定的化合物都可用色谱分离法。尤其在生物大分子分离和制备方面，是其他方法无法代替的。（2）分离效率高。若用理论塔板数来表示色谱柱的效率，每米柱长可达几千至几十万的塔板数，特别适合于极复杂混合物的分离。且通常收率、产率和纯度都较高。,（3）操作模式多样。在色谱分离中，可通过选择不同的操作模式，以适应各种不同样品的分离要求。如可选择吸附色谱、分配色谱和亲和色谱等不同的色谱分离方法；可选择不同的固定相和流动相状态及种类；可选择间歇式和连续式色谱。（4）高灵敏度在线检测。在分离与纯化过程中，可根据产品的性质，应用不同的物理与化学原理，采用不同的高灵敏度检
6、测器进行连续的在线检测，从而保证了在达到要求的产品纯度下，获得最高的产率。,色谱分离的基本概念,分配系数可由Langmuir方程得出Kd-分配系数q、c-溶质在固相和液相中的浓度,（2）、保留时间（tR）和保留体积（VR）：,保留时间（tR）：从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用表示。它与固定相、流动相的性质、柱温、流速、柱体积等因素有关； 保留体积（VR）：从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积，又称洗脱体积。反映样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一,（3）、色谱柱的理论塔板数、塔板高度,Martin 在1941年提出了色谱的塔
7、板理论，把色谱柱比作蒸馏塔。虽这一理论没有揭示出色谱过程的本质，却形象地描绘了色谱过程的主要特征，并给出了衡量色谱柱效率的指标-理论塔板数、塔板高度。它们反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系,理论塔板数的计算方法：N-理论塔板数 tR-保留时间W1/2-半峰宽 Wb-峰底宽度,理论塔板高度：L为色谱柱的柱长,（4）阻滞因子Rt阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,5.1.2色谱图,混合液经过一个色谱层析柱后，在对组分进行洗脱时，由于迁移速度的差异和分子的扩散，各组分
8、在流出色谱分离柱时，其流出的先后顺序和浓度分布是不一样的。如果以流出组分的洗脱时间或洗脱体积为横坐标，以分离组分的浓度或相应的检测信号为纵坐标，便形成峰形的浓度分布，称为色谱峰。,多个组分流过色谱柱后，形成连续出现的多处色谱峰，这些色谱峰构成的图形称为色谱图。单个组分的色谱图示例见下图，,基线，指当没有样品进入检测器时，检测器给出不变的信号。峰高，即色谱峰的顶点到基线的垂直距离。半峰高度，峰高一半处的宽度。峰底宽，由色谱峰两边拐点做切线，与基线相交，两交点间的距离即是峰底宽。峰面积，即色谱峰曲线所形成的面积。,色谱图是色谱分离的重要理论依据，色谱图可以给我们提供如下的重要信息：,根据峰的多少可
9、以判断样品是否为纯化合物。出现多少个峰起码就有多少个这些峰所代表的组分。说明分离情况，评价色谱柱对性质相近组分的分离度，亦即分辨率。峰之间分得越开，分离情况就越好。提供组分出现的时间和体积数据。根据这些数据可对组分进行适当地收集和分离。根据峰高和峰面积进行定量计算。,5.2 吸附色谱(adsorption chromatography),固定相为吸附剂的柱色谱法称为吸附柱色谱法。,5.2.1原理：1、吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程。利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离吸附剂由载体
10、和配位体组成。,吸附过程通常包括：待分离料液与吸附剂混合、吸附质被吸附到吸附剂表面、料液流出、吸附质解吸回收等四个过程。吸附柱色谱法吸附过程是样品中各组分的分子（X）与流动相分子（Y）争夺吸附剂表面活性中心（即为竞争吸附）的过程。利用被分离组分在固体表面活性吸附中心吸附能力的差别而实现分离。,流动相中组分的分子Xm与吸附在吸附剂表面的流动相分子Ya相置换，结果组分的分子被吸附，以Xa表示。流动相分子回到流动相之间，以Ym表示。吸附平衡常数称为吸附系数（Ka）,可近似用浓度商表示：,因为流动相的量很大，Ymn/Yan近似于常数，且吸附只发生于吸附剂表面，所以，吸附系数可写成：式中，Sa为吸附剂的
11、表面积，Vm为流动相的体积。吸附系数与吸附剂的活性，组分的性质和流动相的性质有关。,2、吸附等温线,概念：当温度一定时，吸附量与浓度之间的函数关系称为吸附等温线。,Langmuir吸附等温线qo和K是经验常数，c代表溶液中溶质浓度蛋白质分离提纯时适合此吸附方程。,5.2.2常用吸附剂,5.2.2.1对吸附剂的要求吸附剂的表面积、含水量、颗粒大小等都对分离效果有一定的影响，因此对吸附剂有如下要求：表面积，每克吸附剂有200-800m2表面积，其线性容量较大，有一定的吸附能力；含水量，吸附剂含水量小，吸附能力强。因此水通常作为极性吸附剂的减活剂；,吸附剂与流动相（样品）不发生化学反应；吸附剂颗粒直
12、径适宜，一般吸附剂的粒径为100-200目或200-300目。吸附剂通常应具备以下特征：对被分离的物质具有较强的吸附能力、有较高的吸附选择性、机械强度高、再生容易、性能稳定、价格低廉。,5.2.2.2常用吸附剂种类,1、活性炭： 含碳原料经碳化和活化后便成为活性炭。是一类具有吸附性能的碳基物质的总称，具有多孔结构和很大的比表面。活性炭性能稳定，抗腐蚀，常用于食品工业的脱色、脱臭、净化，也用于环境保护中的三废处理等。,a.是非极性吸附剂，因此对非极性溶质在水中吸附能力大于有机溶剂中的吸附能力。 b.当（洗脱）溶剂的极性降低时，则活性炭对非极性溶质的吸附能力随之减弱；c.从活性炭柱上洗脱被吸附物质
13、时，溶剂的洗脱能力将随溶剂极性的降低而增强。,2、硅胶是一种坚硬、多孔结构的固体颗粒，分子式为SiO2.H2O, 制备时用硫酸处理硅酸钠水溶液使之生成凝胶，经水洗、除硫酸后干燥即为硅胶。硅胶易吸附极性物质（水、甲醇等），而难于吸附非极性物质。,硅胶作为吸附剂有较大的吸附容量，分离范围广，能用于极性和非极性化合物的分离，如有机酸、挥发油、黄酮、氨基酸、皂甙等。,氧化铝：适宜分离植物中的碱性成分如生物碱。,5.2.3流动相及其选择,流动相的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离组分分子竞争占据吸附剂表面活性吸附中心的过程。强极性的流动相分子因占据极性中心的能力强，而具有强的洗脱作用；非极性的流动相分子
14、竞争占据吸附活性中心的能力弱，洗脱作用就弱。因此，为了使样品中吸附能力稍有差异的各组分得到分离，就必须根据样品的性质、吸附剂的活性选择适当极性的流动相。,（1）被测物质的结构、极性与吸附力物质的结构不同，其极性也不同，在吸附剂表面的吸附力也不同。常见化合物的极性（吸附能力）有下列顺序：烷烃 烯烃 醚 硝基化合物 二甲胺 酯 酮 醛 胺 酰胺 醇 酚 羧酸,（2）流动相的极性,流动相的洗脱能力主要是由其极性决定，强极性流动相占据吸附中心的能力强，其洗脱能力强，使组分的k值小，保留时间短。常用溶剂的极性（洗脱能力）的顺序大体是：石油醚 环己烷 二硫化碳 三氯乙烷 苯 甲苯 二氯甲烷 氯仿 乙醚 乙
15、酸乙酯 丙酮 正丁醇 乙醇 甲醇 吡啶 酸,（3）吸附剂和流动相的选择原则,以硅胶或氧化铝为吸附剂的柱色谱分离极性较强的物质时，一般选用活性较低的吸附剂和极性较强的流动相，使组分能在适宜的分析时间内被洗脱和分离。如果被分离的物质极性较弱，则宜选用活性较高的吸附剂和极性较弱的流动相，使组分有足够的保留时间。以聚酰胺为吸附剂时，通常用水溶液作流动相，如不同配比的醇-水、丙酮-水及二甲基甲酰胺-氨水等溶液。,5.2.5吸附色谱的操作程序,吸附色谱法的操作方式有薄层色谱和柱色谱法。薄层色谱是将吸附剂均匀铺在玻璃上，把待分离的样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的。,吸附色谱的
16、柱色谱法是将分离样品均匀加入到装有吸附剂填料的柱子内，再以适当的洗脱剂洗脱以达到不同组分的分离。具体如下：,（1）吸附柱的选择：酸性物质分离宜用硅胶柱，碱性物质分离选用氧化铝柱。实验室常用色谱柱的内径与柱长之比一般在1：151：20。（2）吸附剂的使用情况: 用量 为样品量的30-60倍，据此选用适当规格的色谱柱。 规格： 100目左右,（3）样品的加入（上样）：尽可能选用极性小的溶剂溶解样品及其装柱。常用的上样方法有干样上样和湿法上样。若样品溶于开始洗脱时的有机溶剂时，直接将样品溶于该有机溶剂中，再轻轻注入已准备好的色谱柱上，此法为湿法上样。,（4）洗脱：洗脱用溶剂的极性宜逐步增加，跳跃不能
17、太大。实践中多用混合溶剂，并通过巧妙调节比例以改变极性。一般选用TLC展开时使组分阻滞因子Rf值达到 0.20.3的溶剂系统。实际多用混合有机溶剂系统进行洗脱。分离酸性物质时，常在洗脱溶剂中加入少量醋酸；分离碱性物质时，则在洗脱溶剂中加入少量氨水或吡啶或二乙胺。,按照极性增强顺序，常用混合洗脱溶剂体系如下： (己烷/苯) (苯/乙醚) (苯/乙酸乙酯) (氯仿/乙醚) (氯仿/乙酸乙酯) (氯仿/甲醇) (丙酮/水) （甲醇/水）展开剂的洗脱能力及极性比较,5.3 离子交换色谱,5.3.1 概念与基本原理：,概念：以离子交换树脂作为固定相，通过固定相表面带电荷的基团与样品离子和流动相离子进行可
18、逆交换，选择合适的溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲合力的不同而得到分离的方法。,基本原理：用离子交换树脂分离不同离子时，样品组分离子与流动相离子在树脂上产生竞争交换，交换能力弱的离子易被流动相洗脱。离子的交换能力可用选择系数表示。选择系数大的离子交换能力强，保留时间长。离子按选择系数的大小顺序洗脱出柱。,5.4.2离子交换树脂的构成、分类1、离子交换树脂的构成（1）具有三维空间离体结构的网络骨架（2）联接在骨架上的活性基团（3）活性基团所带的相反电荷的活性离子（可交换离子）,树脂的网络骨架,离子交换的分类,按活性基团分类，可分为阳离子交换树脂(cation exchange)（含酸性基团
19、）和阴离子交换树脂(anion exchange)（含碱性基团）。具体又可以分为：强阳、弱阳 强阴、弱阴,3、常用的离子交换树脂，按酸碱性可以分为：,（1）强酸性阳离子交换树脂：活性基团是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；（2）弱酸性阳离子交换树脂：活性基团有-COOH，-OCH2COOH，C6H5OH等弱酸性基团；（3）强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季铵基团，如三甲胺基或二甲基-羟基乙基胺基；（4）弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺，碱性较弱；,4、 常用的离子交换树脂,(1)多糖基离子交换树脂固相载体为多糖类物质，亲水性强、交换空间大、对生物大分子物致变性作
20、用。A.葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶离子交换树脂骨架为葡聚糖凝胶，如sepharose、sephadex，根据功能基团的不同，亦可分为阳离子交换和阴离子交换树脂命名方法：交换活性基团+骨架+原骨架编号特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率常用的葡聚糖凝胶离子交换树脂：CM-sephadex C-25、DEAE-sephadex A-25、 QAE-Sephadex A-25、SP-Sephadex C-25等,B.纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel Cellex系列离子交换纤维素 树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换纤维素和阴离子交换纤维素两
21、类特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高常用的离子交换纤维素有： 甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素、二乙基氨基乙基纤维素,DEAE anion exchanger,CMC Cation Exchanger,C. 琼脂糖系列离子交换剂 Sepharose系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Fast Flow Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,(2) 新型离子交换树脂,A.大孔离子交换树脂 大孔离子交换树脂具有和大孔吸附剂相同的骨架结构，在大孔吸附剂合成后（加入致孔剂），再引入化学功能基团，便可得到大孔离子交换树脂,大
22、孔离子交换树脂的优点,通过在合成时加入惰性致孔剂，克服了普通凝胶树脂由于溶胀现象，产生的“暂时孔”现象，从而强化了离子交换的功能；减少了凝胶树脂在离子交换过程中的“有机污染”现象（大分子不易洗脱）；可以通过致孔剂选择调整孔径大小、树脂的比表面积，以适应不同的分离要求。常用的致孔剂有：良溶剂（能与单体互溶的）甲苯、四氯化碳；不良溶剂 长链醇（碳4-10） 煤油；高分子聚合物 聚苯乙烯、聚丙烯酸酯,Source 系列离子交换剂特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低阳离子交换树脂 S系列阴离子交换树脂 Q系列MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）特点：介质为亲水性聚醚，具有和So
23、urce系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。同样分为Q系列和P系列,5.3.3离子交换树脂的理化性能,（1）外观：球形、浅色为宜，粒度大小为1660目90%；（2）机械强度：90%；（3）含水量：0.30.7g/g 树脂；（4）交换容量：重量交换容量、体积交换容量、工作交换容量或称表观交换容量（在某一条件下）；,（5）稳定性：化学稳定性、热稳定性；（6）膨胀度：交联度、活性基团的性质与数量、活性离子的性质、介质的性质和浓度、骨架结构；（7）湿真密度：单位体积湿树脂的重量；（8）孔度、孔径、比表面积,离子交换机理,A+自溶液中扩散到树脂表面A+从树脂表面进入树脂内部的活性中心A+与RB在活
24、性中心上发生复分解反应解吸附离子B+自树脂内部扩散至树脂表面B+离子从树脂表面扩散到溶液中交换速度的控制步骤是扩散速度，不同的分离体系可能由内部扩散或外部扩散控制,5.4.4影响交换速度的因素,（1）颗粒大小：愈小越快（2）交联度：交联度小，交换速度快（3）温度：越高越快（4）离子化合价：化合价越高，交换越快,（5）离子大小：越小越快（6）搅拌速度：在一定程度上，越大越快（7）溶液浓度：当交换速度为外扩散控制时，浓度越大，交换速度越快,5.4.5 影响离子交换色谱分离的因素（1）离子交换树脂的交联度和交换容量离子交换树脂中交联剂的含量称为交联度（degree of cross linkage）
25、。通常以重量百分比表示，即合成树脂时二乙烯苯在原料中所占总重量的百分比。交换容量（exchange capacity）是指每克树脂能参加交换反应的活性基团数。通常以每克干树脂或每毫升溶涨后的树脂能交换离子的毫摩尔数来表示，一般为1-10mmol/g。它反映了离子交换树脂进行交换反应的能力，决定于网状结构内所含有的酸性或碱性基团的数目。,在一定范围内树脂的交联度越大，交换容量越大，组分的保留时间越长。但交联度不影响价数相同的离子的分离。交联度与树脂空隙大小有关，交联度大，形成网状结构紧密，网眼小，选择性高。但是交联度过大，会造成网眼过小，体积较大的离子甚至难于扩散到树脂内部，而降低了交换容量。,
26、（2）流动相的组成和pH交换能力强的配衡离子组成的流动相有较强的洗脱能力。调节pH的作用主要体现在对弱电解质离解的控制，溶质的离解受到抑制则保留时间变短。,（3）温度稀溶液温度的改变对交换的性能影响不大，但在0.1mol/L以上浓度时，温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附。,5.3.5离子交换操作步骤1、树脂的选择与预处理根据实验的要求，可以选择不同规格的树脂。首先了解其性能如交换量的大小、颗粒大小、耐热性、酸碱度，然后进行预处理物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；,3、上样一般使用阳离子交换树脂，样品可以加到全交换容量的1/2。使用阴离子交换树脂，样品可以加到全交换容量的
27、1/4-1/3。4、洗脱将上好样的色谱柱加流动相洗脱，流动相的选择参考有关文献。洗脱方法：（a）改变溶液pH值；（b）改变溶液离子强度,5、再生是指是离子交换树脂重新具有交换能力的过程。酸性阳离子树脂 酸-碱-酸-缓冲溶液淋洗碱性阴离子树脂 碱-酸-碱-缓冲溶液淋洗方式有：顺流再生和逆流再生,5.3.6离子交换应用实例（离子交换法提取蛋白质）,1、蛋白质的结构特点多肽链电荷分布不均匀疏水性不同的蛋白质具有不同的表面电荷分布,H值对蛋白质荷电情况的影响,2、蛋白质的滴定曲线不同的蛋白质由于其氨基酸组成的差异，具有不同的等电点（pI），当溶液（环境）pH值低于其pI时，蛋白质带正电荷，而当环境pH
28、值高于其等电点时，蛋白质带负电荷，且偏离等电点越多，其所带电荷越多；,3、缓冲液pH的选择离子交换是依据不同蛋白质荷电性质以及大小差异进行分离的，因此缓冲液的选择将直接影响蛋白质的荷电情况，对于分离的选择性具有重要影响。,Equilibration,4、离子交换分离蛋白质的基本步骤蛋白质的离子交换分离同样要经过：平衡、吸附、洗脱和再生四个阶段，具体过程如下图所示：,常用于蛋白质提取分离的离子交换剂,要求：良好的亲水性、具有较大的均匀网格结构、粒度越小分辨率越高种类：多糖类 离子交换纤维素 交联葡聚糖 交联琼脂糖 聚乙烯醇类 Mono系列 Amersham Pharmacia,期中作业,每5人一组，选一个题目，做成PPT,选派一名同学上台讲10分钟左右。具体要求：挑选一种课程中讲到的分离技术；组之间不要重复。内容：（1）该分离技术的发展历史；（2）具体应用例子，要详细、具体。（3）操作步骤及注意事项。,
