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1、植物器官和组织培养,第一节 植物器官和组织培养的基本程序第二节 植物营养器官培养第三节 植物繁殖器官培养第四节 植物组织培养第五节 常见污染问题和解决方案,植物器官培养（Organ culture ） ：对植物某一器官（营养器官和繁殖器官）的全部或部分或器官原基进行离体培养的技术。如根、茎、叶、花、果实、种子等。 植物组织培养（Tissue culture） ：对植物组织（分生组织、形成层组织、表皮组织、薄壁组织等）及培养产生的愈伤组织进行离体培养的技术。,第一节 植物器官和组织培养的基本程序,一、无菌外植体的获得二、初代培养物的建立三、形态发生和植株再生四、培养物的观察记载,一、无菌外植体的
2、获得,从自然界或室内采集的植物器官和组织携带有各种微生物，容易造成培养基和培养材料的污染，污染是组织培养的一大障碍。 处理外植体的重要工作是灭菌。不同植物或同一植物不同器官、不同组织，灭菌的方法不同。,1、茎尖、茎段、叶片的灭菌,茎尖、茎段、叶片,清水清洗、吸干,0.1%-0.2%氯化汞浸泡2-10min,70%酒精浸泡10-30s,10%次氯酸钙浸泡10-20min,70%酒精浸泡10-30s,2%次氯酸钠浸泡15-30min,无菌水冲洗3-5次,分割后接种,2、根、块茎、鳞茎的灭菌,特点：生长在土中，挖取时易受伤，灭菌较困难,清水清洗、切除损伤部位,70%酒精浸泡10-30s,6-10%次
3、氯酸钠浸泡5-15min,无菌水冲洗3-5次,分割后接种,根、块茎、鳞茎,0.1%-0.2%氯化汞浸泡5-12min,3、花蕾的灭菌,特点：未开放花蕾中的花药被花被包裹，处于无菌状态。可直接灭菌。,70%酒精浸泡10-30s,无菌水冲洗3-5次,接种,花蕾,0.1%氯化汞浸泡3-10min,1%次氯酸钠浸泡10-20min,4、果实、种子的灭菌,无菌水冲洗3-5次,接种,种子,0.1-0.2%氯化汞浸泡5-10min,10%次氯酸钠浸泡20-30min,特点：这类材料的表皮有茸毛或蜡质需在灭菌剂中加入几滴吐温-80，以增加灭菌效果。,清水清洗、吸干,果实,70%酒精浸泡10-30s,2%次氯酸
4、钠浸泡10-20min,常用表面灭菌剂使用浓度和效果,二、初代培养物的建立,无菌环境,规范操作,条件合适,组织内无菌,培养基无菌,接种器械无菌,工作台无菌,技术熟练,经验丰富,培养基种类,激素种类和浓度,外植体来源,外植体生理状态,培养条件,手及工作服消毒,配套技术,三、形态发生和植株再生,外植体,愈伤组织,胚状体,器官分化,植株,有根茎的两极器官,植株,先茎后根单极器官,先根后茎单极器官,脱分化,再分化,芽或芽原基起源于表层细胞（外起源）,根芽原基起源于深层细胞(内起源),四、培养产物的观察记载,1、愈伤组织,愈伤组织的类型和色泽,愈伤组织诱导率=,愈伤组织生长量=培养一段时间后愈伤组织重
5、接种时愈伤组织重,产生愈伤组织的外植体数,外植体总数, 100%,2、胚状体,胚状体诱导率=,产生胚状体的外植体数,外植体总数, 100%,3、芽,芽分化率=,产生芽的外植体数,外植体总数, 100%,4、根,先诱导芽后诱导根时，发根率=,培养芽数, 100%,发根芽数,第二节 植物营养器官培养,一、植物根段培养二、植物茎段培养三、植物叶培养,离体根培养的意义： 是研究根系生理代谢、器官分化及形态建成的良好实验体系； 对生产某些药物有重要作用，因为有些化合物只能在根中形成。 离体根的培养多见于草本。 注：自然条件下生长在土壤中的根，解决消毒问题非常困难，在离体根培养中，常用无菌苗的根作为培养材
6、料。,一、植物根段培养,离体根的无性系：由单个直根衍生，并经继代培养而保持遗传性一致的根的培养物。,1、根无性系的建立,建立根无性系的方式,根的直接增殖,根的间接增殖,无菌根切段接种在低盐培养基（如White或1/2MS培养基）中，25，暗培养，根段形成主根和侧根，每隔7-10天继代一次，取主根增殖。,无菌根切段接种在愈伤组织诱导培养基中，诱导愈伤组织，而后再生植株。,根切段的培养方法,固体培养法,液体培养法,根切段平放在液体培养基中，摇床上震荡培养。,根切段根尖方朝上浸露在液体培养基中，另一端插在固体培养基中。,固-液双层培养法,根切段平放在固体培养基上。,2、影响离体根发生和生长的因素,基
7、本培养基,植物材料,光温条件,低盐培养基,蔗糖浓度低1-3%,生长素利于生根,植物种类：木本困难,植物部位,发育年龄,不同材料有差异,黑暗利于根形成,要求温度较低，16-25,基因型,生长调节剂,培养方式,H值,培养方式对发根率有影响,大蒜根尖培养及植株再生,二、植物茎段培养,1、概念 植物茎段培养：对植物的带有一个以上定芽或不定芽的外植体（包括块茎、球茎、鳞茎在内的幼茎切段）进行离体培养的技术。,2、茎段培养的目的茎段用于植物离体快繁； 获得突变体 ；理论基础研究。,3、茎段培养过程,表面消毒的茎段,切成几厘米长带节的节段,接种到固体培养基,直接发生不定芽,形成愈伤组织,再生苗,生根培养基,
8、植 株,茎段培养过程示意图,取健壮茎段,去叶片后自来水冲洗,再生,MS培养,75%酒精1分钟,次氯酸钠5-10分钟,0.1%升汞,注意事项： 嫩茎段常作为快速繁殖的外植体：即当年萌发或新抽出的尚未完全木质化的枝条，其细胞的可塑性大，容易离体培养。 体积小、不带叶原基的外植体培养难，成苗所需时间长，体积大的易于成功。,4、影响茎段芽增殖的因素 细胞分裂素和生长素的配比是关键！,其它因素的影响：如月季茎段增殖培养 1、腋芽在茎段上的位置。每段的一个腋芽培养在无激素的基本培养基上，23天后，靠近枝条两端的芽发育最慢，枝条中部的芽发育最快。 2、去除茎顶端的作用。继代培养接种时切去嫩茎的顶芽后，再转接
9、于新鲜培养基上，能促进嫩茎的增殖。 3、嫩茎长度对形成多芽苗的影响。茎段为1-10 mm长短时，对形成多芽苗最有效，而且每个茎段的侧枝数也较多，若切割过短(小于1mm)或过长(11-15mm)都对茎的增殖不利。,三、植物叶培养,1、概念 以植物的叶器官（叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、叶肉、子叶等）为外植体进行离体培养的技术。,2、用途 （1）研究叶形态发生过程； （2）研究光合作用、叶绿素形成； （3）研究遗传转化。,3、优点 （1）多数植物的叶片具有很强的再生能力； （2）数量多、取材方便。,4、叶培养的基本过程,取叶片,70%酒精浸泡30s,0.1%升汞浸泡数分钟,接种在固体培养基上,愈伤组织
10、,胚 状 体,再生植株,多数情况下是这种途径,5、影响叶培养的因素,植物激素的种类和浓度是关键因素。,注：一般叶培养比茎段培养困难。,叶片诱导丛生芽生根培养移栽。 取嫩叶 70酒精浸泡30s 0.1升汞溶液消毒5-8 min 无菌水冲洗数次 切成0.5-1 cm的小块接种于MS + 1 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA固体培养基上 光照下培养，35天后叶片直接分化出丛生芽 小丛生芽转接于1/2 MS + 0.2 mg/L IBA的培养基上，接种10天后，主茎叶片明显增大，根分化，15天后即可移栽。,举例：非洲紫罗兰嫩叶离体培养的过程,叶片离体培养过程,芦荟的植物组织培养过程,1
11、 2 3 4 5,6 7 8 9,10 11,A,B,E,C,花烛叶片离体培养及植株再生,第三节 植物繁殖器官培养,一、植物花器官培养二、植物幼果培养三、植物种子培养,一、植物花器官培养,1、概念 对植物的整朵花或花的组成部分（花托、花柄、花瓣、花丝、子房、花药、胚珠等）进行离体培养的技术。,2、用途 用于性别决定、果实和种子发育、花形态发生的研究。,3、基本过程,花器官灭菌处理,适当切割,固体培养基培养,成熟果实,不定芽或丛生芽,愈伤组织,再生植株,如人参、番茄、葡萄的花蕾培养,如花椰菜的花托培养,如菊花的花托、花瓣培养,4、花药培养,花药培养(anther culture):把发育到一定阶
12、段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程.,Tobacco anther with developing haploid plantlet, arising from the microspore,2、花药培养的基本程序是： 外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养-移栽,5、花粉及小孢子培养概念花粉培养(pollen culture):也叫小孢子培养(microspore culture),是从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.,优点（与花药培养比）：a、花药培养容易受药壁、花丝、药隔
13、等体细胞组织的影响，再生植株会出现不同倍性的个体，而分离的花粉培养可以克服这一不足。b、能更好调节控制核发育的各种因子，而且可以直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程，为研究雄核的生理生化等问题提供方便。c、原则上将，从花粉培养能得到更多的花粉植株。,二、植物幼果培养,1、概念：对植物不同发育时期的幼小果实进行离体培养的技术。 2、用途：用于果实发育、种子形成和发育等方面的研究。 3、培养过程：培养后直接得到的常是成熟果实或愈伤组织。,三、植物种子培养,1、概念：对受精后发育不全的未成熟种子进行离体培养的技术。 2、用途： 打破种子休眠，缩短生活周期； 挽救远缘杂种，提高杂种萌发率。 获三倍体
14、或单倍体植株,3、培养过程及特点： 培养的直接产物有：小植株，愈伤组织，丛生芽或不定芽。 种子培养要求糖浓度较低（1-3%），培养目的不同，培养基不同。 成熟种子成苗：培养基简单，不加生长调节剂； 未成熟种子成苗：培养基成分较全，需加生长调节剂； 培养种子产生愈伤组织或不定芽：培养基成分、营养物质全面，添加不同种类、浓度的生长调节剂。,胚胎培养是指使胚或具胚器官在离体无菌条件下发育成幼苗的技术。 根据在培养中所取的外植体的部位不同，植物胚胎培养包括胚培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养。 胚珠和子房培养由于取材的时期不同，又包括： 受精以后的胚珠子房培养 未受精胚珠和子房,成熟胚培养,幼胚培养,
15、胚乳培养胚乳培养的研究主要集中在以下一些问题的探讨： A、胚乳细胞的全能性。 B、能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实； C、研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。,Triticum grain,到目前为止，已有40多种植物的胚乳进行了培养。其中苹果、柚、橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等的胚乳培养得到了再生植株。其它有的分化出芽、根、叶等或得到愈伤组织。,Plantlets arising from isolated endosperm tissue,第四节 植物组织培养,离体植物组织培养对研究形态发生、器官发生、植株再生、植株脱毒、组织培养基础理论的建
16、立等具有重要的作用，在整个离体培养研究中占有重要的地位。,植物组织培养,分生组织培养,愈伤组织培养,薄层组织培养,顶端分生组织（根尖、茎尖等）,形成层组织,对植物的薄细胞层进行离体培养的技术。如灭菌后的器官切取3-6层薄细胞层（如3-6层表皮细胞及表皮下细胞组成的薄层组织）,一、植物分生组织培养,分生组织培养的特点： 生命力强； 分裂能力持久； 培养时易发生细胞分化再生植株； 利于获得无病毒植株。,1、茎尖培养研究最为深入，广泛用于植株再生和脱病 毒的研究及应用2、茎尖培养可能发育的方向： （1）芽萌发 （2）产生胚状体 （3）产生不定器官 （4）形成愈伤组织3、影响发育方向的因素 （1）茎尖
17、大小（用于脱毒的茎尖小，快繁的茎尖大） （2）培养条件 （3）生长调节剂的种类和浓度4、茎尖培养常用的培养基：MS培养基5、注意事项：不得使用2，4-D，避免产生愈伤组织。,二、植物愈伤组织培养,愈伤组织培养的作用： 1、研究脫分化、再分化、生长和发育、遗传变异、育种和次生代谢产物的生产等； 2、是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。愈伤组织培养的条件：黑暗或弱光，25,三、植物薄层组织培养,薄层组织培养的作用： 研究形态发生机理和影响因素及遗传变异产生的机理。,一、污染及控制1、污染的含义：指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。,第五节 组织培养常见
18、问题及对策,2、污染原因（从病原菌分析）（1）细菌污染：菌斑呈黏粘液状，界限比较明显，一般接种后12天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌。（2）真菌污染：菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子接种后310天才能发现。主要是霉菌污染。,3、污染途径：（1）外植体带菌（2）培养基及接种器具灭菌不彻底（3）接种操作时带入（4）环境不清洁,4、污染的预防措施：A、 防止外植体带菌（1） 选择好外植体采集时期和采集部位 外植体采集以春秋为宜； 优先选择地上部分作为外植体； 阴雨天勿采，晴天下午采集； 采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。（2）室内或无菌条件下进行预培养。（3）外植体严格灭菌 灭菌效
19、果实验 多次灭菌和交替灭菌,B、保证培养基及接种器具彻底灭菌1 分装时，注射器勿触瓶口。培养基勿粘瓶口2 检查封口膜是否破损3 扎瓶口要位置适当，松紧适宜4 保证灭菌时间和高压锅内温度5 接种工具用前彻底灭菌6 工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌,C、操作人员严格遵守无菌操作规程,D、 保证接种与培养环境清洁（1） 污染瓶经高压灭菌后再清洗（2）接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消毒（3）定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；接种前1520min打开风机，风速调整到2030m/min，并对台面用75%酒精喷雾消毒（4）定期对培养室消毒，防止高温,二、培养物的不良表现
20、及改进措施 （一）、初始培养阶段1、培养物水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。2.培养物长期培养几乎无反应可能原因：基本培养基不适宜，生长素不当或用量不足，温度不适宜。改进措施：更换基本培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度，增加生长素用量，试用2,4-D，调整培养温度。,3.愈伤组织生长过旺、疏松，后期水浸状可能原因：激素过量，温度偏高，无机盐含量不当。改进措施：减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增
21、加培养基硬度。4.愈伤组织太紧密、平滑或突起，粗厚，生长缓慢可能原因：细胞分裂素用量过多，糖浓度过高，生长素过量。改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。5.侧芽不萌发,皮层过于膨大,皮孔长出愈伤组织可能原因:枝条过嫩,生长素、细胞分裂素用量过多。改进措施：减少激素用量，采用较老化枝条。,6、初代培养外植体的褐变 外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的
22、培养。,（1）、褐变的主要原因如下： 植物品种 研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。 生理状态 由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。,培养基成分 浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深
23、。 培养条件不当 如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。,（2）、减轻褐变现象发生的方法 选择合适的外植体 一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。 合适的培养条件 无机盐成分、植物生长物质水平、适当降低培养基温度，及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。,使用抗氧化剂 半胱氨酸及其盐酸盐、二硫苏糖醇、谷胱甘肽、抗坏血酸等。该类药剂一般需用浓度为50-200mg/L。用经过滤灭菌的药液洗涤刚切割的外植体伤口表面，或加入固体培养基的表层，或将刚切割的外植体浸入其中一定时间。另外，使用0.1%-0.5%的活性
24、炭对防止褐变也有较为明显的效果。 连续转移 对容易褐变的材料可间隔1224h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。,（二）、继代培养阶段 1.苗分化数量少、速度慢、分枝少、个别苗生长细高可能原因：细胞分裂素用量不足，温度偏高，光照不足。改进措施：增加细胞分裂素用量，适当降低温度，改善光照，改单芽继代为团块（丛芽）继代。 2.苗分化过多，生长慢，有畸形苗，节间极短，苗丛密集，微型化可能原因：细胞分裂素用量过多，温度不适宜。改进措施：减少或停用细胞分裂素一段时间，调节温度。,3.分化率低,畸形,培养时间长时苗再次愈伤组织化。可能原因:生长素用
25、量偏高,温度偏高。改进措施：减少生长素用量，适当降温。4.叶粗厚变脆可能原因：生长素用量偏高，或兼有细胞分裂素用量偏高。改进措施：适当减少激素用量，避免叶片接触培养基 5.再生苗的叶缘、叶面等外偶有不定芽分化出来可能原因：细胞分裂素用量偏高，或表明该种植物适于该种再生方式。改进措施：适当减少细胞分裂素用量，或分阶段地利用这一再生方式,6.丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，温度过高，光照短，光强不足，久不转移，生长空间窄。改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素，延长光照时间，增强光照，及时转接，降低接种密度。 7.幼苗淡绿，部分失绿可能原因：无机盐含
26、量不足，pH值不适宜，铁、锰、镁等缺少或比例失调，光照、温度不适。改进措施：针对营养元素亏缺情况调整培养基，调好pH值，调控温度、光照。,8.幼苗生长无力、发黄落叶、有黄叶、死苗夹于丛生苗中可能原因：瓶内气体状况恶化，pH值变化过大，久不转接导致糖已耗尽，营养元素亏缺失调，温度不适，激素配比不当、缺铁等。改进措施：及时转接、降低接种密度，调整激素配比和营养元素浓度，改善瓶内气体状况，控制温度。,9、继代培养时材料的玻璃化 实践表明，当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。它的出现会使试管苗生长缓慢、繁殖系数有所下降。玻璃化为试管苗的生
27、理失调症。 因为出现玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，因此，使繁殖系数大为降低。在不同的种类、品种间，试管苗的玻璃化程度也有所差异。当培养基上细胞分裂素水平较高时，也容易出现玻璃化现象。在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。,呈现玻璃化的试管苗，其茎、叶表面无蜡质，体内的极性化合物水平较高，细胞持水力差，植株蒸腾作用强，无法进行正常移栽。这种情况主要是由于培养容器中空气湿度过高，透气性较差造成的，其具体解决的方法为： 增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势； 减少培养基中含氮化合物的用量； 增加光照； 增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化
28、的现象有明显的作用； 降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生； 降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。,两个“增加”：增加琼脂浓度；增加蔗糖含量； 两个“增强”：增强溶器通风；增强光照； 两个“加入”：加入渗透剂；加入ABA； 一个“减少”：减少培养基氮含量,（三）、生根阶段 1、培养物久不生根，基部切口没有适宜的愈伤组织可能原因：生长素种类、用量不适宜；生根部位氧气不良；生根程序不当；pH值不适，无机盐浓度及配比不当。改进措施：改进培养程序，选用适宜的生长素或增加生长素用量，适当降低无机盐浓度，改用滤纸桥液培养生根等。,2.愈伤组织生长过快、过大，根茎部肿胀或畸形，几条根并联或愈合。可能原因：生长素种类不适，用量过高，或伴有细胞分裂素用量过高，生根诱导培养程序不对。改进措施：调换生长素种类或几种生长素配合使用，降低使用浓度，减少愈伤，改变生根培养程序等。,
