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1、第七章 植物基因转化受体系统,主要内容,1、植物基因转化受体的条件；2、植物基因转化受体的类型及其特性；3、植物基因转化受体系统的建立；4、受体系统常见的问题及其解决途径。,我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。,转基因牵牛花,转基因油菜 油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好,转基因小麦 从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种面
2、包的营养价值高。,第一节 植物基因转化受体的条件,植物基因转化的受体系统：一般是指通过组织培养途径或其他非钻石培养途径，能够高效、温度地再生无性系，并能接受外源基因的整合，对用于转化选择的抗生素敏感的再生系统,高效稳定的再生能力具有较高的再生频率；具有良好的实验稳定性和重复性。较高的遗传稳定性植物周倜系统接受外源基因后不影响吱声非改造遗传体系又能外源基因遗传给后代，保持其遗传的稳定性同时选材时注意尽量减小受体系统体细胞变异的发生,具有温度的外植体来源由于基因转化频率低，实验重复较多，因此需要稳定的外植体来源；常用转化外植体：种子，无菌实生苗的胚轴、子夜或幼叶，一些植物的试管苗，以及可较高频率诱
3、导的营养变态器官。,抗生素敏感性为了便于转化子的筛选需要使用标记基因（如抗生素抗性基因等）选择性抗生素需满足的条件：（1）植物受体材料对所选用的抗生素具有一定的敏感性；（2）抗生素对受体植物没有剧烈的毒性，不会很快杀死植物细胞对抗生素过度敏感或过度钝化的植物材料都不适合于构建植物转基因的受体系统,农杆菌敏感性,农杆菌介导的基因转化由于具有转化效率高、多为单拷贝插入等优点，是常用的植物基因转化方法；使用农杆菌介导的转化方法，需要植物受体对农杆菌敏感在选择农杆菌转化系统前，必需测试受体系统对农杆菌的敏感性,第二节 植物基因转化受体的类型及其特性,由于众多类型的植物离体培养技术的完善，使转基因受体系
4、统有了很大的选择范围不同的受体类型具有不同的缺点，适合的转化方法也不同实际操作中应根据受体的特性，基因转化方法，选择适宜的受体系统,特点,外植体来源广泛扩繁量大，可获得较多的转化植株使用的植物范围广从愈伤组织分化的不定芽的多细胞起源特点，形成嵌合体较多再生植株无性系变异较大，转化的外源基因遗传稳定性较差,注意问题,直接使用外植体组织进行农杆菌侵染时，应注意从活跃生长的植物部位取材用愈伤组织进行转化，应在愈伤组织细胞处于分省细胞状态时进行转化，此时易于接受外援基因，转化效率高愈伤组织必需保持良好的生长状态，继代周期不能太长,不经过愈伤组织的受体系统,不经过愈伤组织的受体系统也称为直接分化再生系统
5、，是指外植体细胞越过脱分化阶段，直接分化出不定芽，从而获得再生植株的受体系统；研究显示，采用叶片、幼茎、子叶、胚轴以及一些营养变态器官为外植体时，在适宜的培养技术控制下，均可直接分化出芽,特点,获得再生知足周期短，操作简单体细胞无性系变异相对较小，可较好的维持受体植株的遗传特性转化的外源基因能稳定遗传（特别是茎尖）同样可能出现较多的嵌合体外植体直接分化出芽较难，转化细胞直接分化成植株难度更大,注意问题,直接分化受体系统比较适合于无性繁殖植物选材：从组织类型上讲，子叶、叶片、胚轴和某些营养变态器官通常比较容易诱导；从细胞状态上讲。薄壁细胞状态外植体较容易诱导,原生质体再生系统,原生质体由于除去了
6、细胞壁的屏障，能够直接高效的摄取外源DNA或遗传物质，甚至细胞核适合于现在建立的所有转化方法,特点,原生质体受体系统利于准确的转化和鉴定转化原生质体获得的转基因植株嵌合体少但由于目前许多的原生质培养体系还不成熟，受原生质体培养技术的限制，转化试验的重复性较差原生质体培养周期长，受体细胞本身的体细胞变异频率高，遗传稳定性差,细胞系及其体细胞胚受体系统,经过筛选和优化的植物细胞悬浮培养的细胞系，具有较好的遗传和生理一致性，经过培养基调节，可形成体细胞胚培养技术相对于原生质体培养来说要容易的多，转化效率优于其他组织培养系统被认为是最为理想的基因转化受体系统,特点,胚性细胞繁殖量大，同步性好，具有较强
7、的接受外源DNA的能力，转化率高转化后胚性细胞可通过体细胞胚途径发育成完整植株，嵌合体少体细胞胚具有双极性，减少了不定芽发育途径中的生根培养过程来自同一体细胞胚的后代个体间遗传背景一致，无性系变异小,生殖细胞受体系统,以生殖细胞如花粉粒和卵细胞为周倜细胞进行基因转化的系统称为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。途径：（1）利用小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，建立单倍体的基因转化受体系统；（2）直接利用划分和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管通道法，花粉粒浸泡法和子房微注射法。,特点：,具有更强的接受外源DNA的潜能转化的基因无显隐性的影响，利于性状的选育，加倍后可迅速获
8、得纯合二倍体新品种花粉管通道法将现代的分子育种与常规育种紧密结合，是十分有潜力的受体系统在花粉或小孢子培养系统作为受体系统更为理想,第三节 植物基因转化受体系统的建立,建立一个好的受体系统是实现基因转化的先决条件受体系统的建立主要依赖于植物组织培养技术，而且要求比一般的组织培养技术要高,一、高频再生系统的建立,高频再生系统必须满足4个条件：（1）外植体的组织细胞具有诱导愈伤组织和再生完整植株的能力，并且最好是外植体能直接分化出芽（2）芽的分化率要高（3）易于离体培养，具有高度可重复性（4）体细胞无性系变异小,外植体的选择,外植体的生理年龄外植体细胞的生理状态外植体的遗传背景外植体的选择与受体系
9、统类型匹配,培养基的选择,植物的营养特性选择原则急速的选择,二、抗生素敏感性,受体系统建立你时，需要对相关的抗生素种类及其浓度进行实验筛选抑制农杆菌生长的抗生素种类和浓度的筛选要考虑植物种类和农杆菌株系两个方面对植物细胞无毒，不显著抑制植物细胞生脏浓度以能够抑制农杆菌生长而不妨碍植物生长的浓度为宜用于转化子筛选的抗生素浓度的确定,三、农杆菌敏感性试验,农杆菌介导的基因转化是目前植物基因转化中使用较广、技术较成熟的实验体系选择农杆菌敏感性较高的受体植物及其适宜的组织细胞类型是成功转化的重要因素转化前可用野生型农杆菌进行侵染试验，筛选敏感性材料,第四节 受体系统常见的问题及其解决途径,再生能力及其
10、遗传稳定性愈伤组织褐化再生植株玻璃化影响受体系统转化效率的因素农杆菌菌株Vir基因活化的诱导外植体的类型和生理状态外植体的预培养外植体的接种及共培养转化细胞的选择培养和转化植株再生,1、以原生质体或细胞为周倜的直接基因转移2、载体介导的基因转化3、种质系统介导的基因转化,1、以原生质体或细胞为受体的直接基因转移,聚乙二醇法电激法脂质体法磷酸钙-DNA共沉淀法显微注射法基因枪法超声波法,PEG介导的基因转化 利用化学试剂，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、多聚-L-鸟氨酸(pLO)和磷酸钙等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，
11、完成遗传转化过程。 第一例成功的转基因烟草就使用该转化方法获得的。,脂质体介导基因转化 利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂质体转入受体细胞。 特点：转化率高；操作繁琐；技术性更高。电激法介导基因转化 利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔” ，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA进入原生质体。 特点：转化率高；操作简便 ；特别适于瞬时表达的研究；容易造成原生质体损伤。,显微注射介导的基因转化 利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。 特点：方法简单、转化率高；适用于各种植物和材料，无局限性；
12、对受体细胞无毒害。激光微束介导的基因转化 将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。 优点：操作简便；工作效率高；适应于各种动植物；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化。,基因枪法(particle gun) 将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。根据基因枪的动力系统，分为3种类型火药爆炸力为加速动力，采用塑料子弹和阻挡板。塑料子弹前端载放着DNA包裹的钨/金粉。高
13、压气体作为动力，如氦气、氢气、氮气等。把载有DNA的钨/金粉铺洒在一张微粒载片上，在压缩空气的冲击下，驱动载片，当载片受阻于金属筛网时，载有DNA的钨/金粉继续向下冲击射入细胞。高压放电为驱动力，可以无级调速，通过变化工作电压，使载有DNA的钨/金粉粒子能达到目的细胞层。,PDS-1000/He系统,基因枪的操作步骤DNA微弹的制备：金粉或钨粉50100mg、DNA、CaCl2、PEG4000和亚精胺靶外植体材料准备DNA微弹轰击轰击后外植体的培养转化率及其影响因素金属微粒的影响DNA沉淀辅助剂的影响DNA的纯度及浓度对转化率的影响微弹速度的影响植物材料的内在因素的影响,2、载体介导的基因转化
14、,农杆菌介导的基因转化病毒介导的基因转化,根癌农杆菌介导法植物冠瘿瘤植物的一种癌症冠瘿瘤的起因：由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)属根瘤菌科(Rhizobiaceat)对植物的侵染而引起冠瘿瘤的侵染过程：细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。,冠瘿瘤,Ti质粒(Tumor inducing plasmid)Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合环状DNA分子，其分子量为95156 106D，约有200kb。Ti质粒的类型： 根据冠瘿瘤合成的冠瘿碱种类不同分为：章鱼碱
15、型 (octopine) 胭脂碱型 (nopaline)农杆碱型 (agropine) Ti质粒的基因结构：T-DNA区、Vir区、Con区和Ori区共4个区段。,Ti质粒的遗传特性T-DNA区 (transfer DNA region) Ti质粒中的一部分DNA片段，进入寄主细胞并插入基因组中，能够利用植物的酶系统进行转录和翻译，其表达产物可诱发植物产生肿瘤。T-DNA区结构特征：左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列(Lb和Rb) ，具有高度保守性。右边界突变和缺失导致转移能力降低或丧失。T-DNA以单拷贝或多拷贝的形式随机整合到植物染色体DNA上。,胭脂碱T-DNA (23kb)
16、pTiC58章鱼碱T-DNA (13.6kb) pTiAch5,NOS：胭脂碱合成酶基因 ocs：章鱼碱合成酶基因；tmr：根性肿瘤基因tms：芽性肿瘤基因；tml：大肿瘤基因,Vir区(毒性区)在Ti质粒T-DNA区的上游的一组基因。表达产物激活T-DNA向植物细胞转移，使植物引发肿瘤。 Con区含有农杆菌之间接合转移有关的基因(tra)Ori区(复制起始区)调控Ti质粒自我复制。,取代型Ti质粒克隆载体 用E.coli质粒克隆载体取代野生型Ti质粒的全部或部分T-DNA核苷酸序列，构建的载体。 onc-Ti质粒克隆载体 T-DNA上Onc基因被取代；保留T-DNA的两端边界序列和nos基因
17、。 onc+Ti质粒克隆载体 T-DNA上的部分序列被pBR322所取代，仍保留Onc基因。进入植物细胞后，可诱发冠瘿瘤，如pGV3850和pMPG1。,GV3850从胭脂碱Ti质粒pTiC58衍生而来含有T-DNA边缘区，以及除T-DNA以外全部的DNA序列临近右侧边缘区(RB)编码胭脂碱合成酶的nos基因，供作鉴定转化细胞的记号缺失的T-DNA核心区由pBR322序列取代,35S启动子是植物基因工程中常用的组成型启动子,中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒克隆载体，承载外源基因后，须先在辅助质粒推动下进入农杆菌，再在农杆菌介导下送入植物细胞。共整合克隆载体系统利用体内重组技术构建大型无毒的Ti质粒重组体双元克隆载体系统 将带有外源目的基因的T-DNA和Vir区，安置在不同的质粒载体上进行操作。 特点：由两个彼此相容的Ti质粒组成 含有Vir区的质粒；含有T-DNA区段的DNA转移质粒,共整合克隆载体系统,双元Ti载体系统,根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理农杆菌对受体的识别农杆菌附着到植物受体细胞诱导启动毒性区基因表达类似接合孔复合体的合成和装配T-DNA的加工和转运T-DNA的整合,3、种质系统介导的基因转化,花粉管通道法生殖细胞浸泡法胚囊、子房注射法,
