氨基酸的定量测定ppt课件.ppt

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1、,氨基酸的定量测定,一、氨基酸的一般定量测定,1、甲醛滴定法2、电位滴定法3、茚三酮比色法4、非水溶液滴定法5、邻苯二甲醛法6、三硝基苯磺酸法7、乙酰丙酮法,二、个别氨基酸的定量测定,1、赖氨酸的测定2、色氨酸的测定3、苯丙氨酸的测定4、酪氨酸的测定5、脯氨酸的测定6、羟脯氨酸的测定7、胱氨酸的测定8、谷氨酸的测定,一、氨基酸的一般定量测定,1、甲醛滴定法,原理：氨基酸具有酸性的羧基（COOH）和碱性的氨基（NH2），它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。,1、甲醛滴定法

2、,特点：简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近 应用：脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低 酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高 溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高试剂：40%中性甲醛溶液（以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠溶液将 40%甲醛中和至淡蓝色） 1g/L百里酚酞乙醇溶液 1g/L中性红50%乙醇溶液 0.1mol/L氢氧化钠标准溶液,1、甲醛滴定法,操作方法：吸取含氨基酸2030mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中一份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红色变为琥珀色为终

3、点；另一份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1min，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的氢氧化钠标准溶液体积。,1、甲醛滴定法,计算结果： 氨基酸态氮含量= 式中：c氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L V1用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL V2用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL m测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014 N2毫摩尔质量，g/mmol,1、甲醛滴定法,注意事项：此法适用于测定食品中的游离氨基酸固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直

4、接吸取试样进行测定。萃取可在50水浴中进行0.5h即可。若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和COOH时的pH为8.59.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。,2、电位滴定法,原理:根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成原电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH判断滴定终点。仪器：酸度计 磁力搅拌器 微量滴定管试剂：20%中性甲醛溶液 0.05mol/L氢氧化钠标准溶液,2、电位滴定法,操作方法： 吸

5、取含氨基酸约20mg的样品溶液于100mL容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取20.0mL置于200mL烧杯中，加水60mL，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL），供计算总酸含量。 加入10.0mL甲醛溶液，混匀，再加上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积（mL）。 同时取80mL蒸馏水置于另一200mL洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至pH8.2，再加入10.0mL中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至pH9.2，作为试剂空白试验。,2、电位滴定法,结果计算：

6、氨基酸态氮含量=式中：V1样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（pH9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL V2空白试验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，mL c氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L m测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014 N2毫摩尔质量，g/mmol,2、电位滴定法,说明：本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定浑浊和色深样液可不经处理而直接测定,3、茚三酮比色法,原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。 该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为750nm，故据此

7、可以测定样品中氨基酸含量。仪器：可见分光光度计试剂：20g/L茚三酮溶液pH8.04磷酸盐缓冲溶液氨基酸标准溶液（200g/mL）,3、茚三酮比色法,操作方法：标准曲线绘制：准确吸取200g/mL的氨基酸标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL（相当于0、100、200、300、400、500、600g氨基酸），分别置于25mL容量瓶或比色管中，各加水补充至容积为4.0mL，然后加入茚三酮和磷酸盐缓冲溶液各1mL，混合均匀，于水浴上加热15min，取出迅速冷却至室温，加水至标线，摇匀。静置15min后，在570nm波长下，以试剂空白为参比液测定其余各溶液的吸光度A。以

8、氨基酸的微克数为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线。样品测定：吸取澄清的样品溶液14mL，按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光度A值，测得的A值在标准曲线上可查得对应的氨基酸质量。,3、茚三酮比色法,结果计算： 氨基酸含量= （mg/100g）式中：m从标准曲线上查得的氨基酸的含量，g m1测定的样品溶液相当于样品的质量，g,注意事项：通常采用的样品处理方法为：准确称取粉碎样品510g或吸取样液样品510mL置于烧杯中，加入50mL蒸馏水和5g左右活性炭，加热煮沸，过滤，用3040mL热水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，加水至标线，摇匀备测。茚三酮受阳光、空气、温度、湿度等影

9、响而被氧化呈淡红色或深红色，使用前须进行纯化，方法如下： 取10g茚三酮溶于40mL热水中，加入1g活性炭，摇动1分钟，静置30分钟，过滤，将滤液放入冰箱中过夜，即出现蓝色结晶，过滤，用2mL冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，装瓶备用。,3、茚三酮比色法,4、非水溶液滴定法,原理：氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰醋酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。根据酸碱的质子学说：一切能给出质子的物质为酸，能接受质子的物质为碱；弱碱在酸性溶剂中碱性显得更强，而弱酸在碱性溶剂中酸性显得更强，因此本来在水溶液中不能滴定的弱碱或弱酸，如果选择适当的溶剂使其强度增加，则可以顺利地滴定。氨基酸有氨基和羧基，在水中呈现

10、中性，假如在冰醋酸中就显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。本法适用于氨基酸成品的含量测定，允许测定的范围是几十毫克的氨基酸。,4、非水溶液滴定法,操作方法：直接法（适用于能溶解于冰醋酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg左右，溶解于20mL冰醋酸中，加两滴甲基紫指示剂，用高氯酸标准液滴定，终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰醋酸，滴定至同样终点颜色。 氨基酸含量=式中：VHClO4所消耗的高氯酸标准溶液的体积 cHClO4所消耗的高氯酸标准溶液的浓度 M被测氨基酸的摩尔质量 m被测氨基酸的质量,4、非水溶液滴定法,回滴法（适用于不易溶解于冰醋酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）

11、：精确称取氨基酸样品3040mg 左右，溶解于5mL高氯酸标准溶液中，加2滴甲基紫指示剂，剩余的酸以醋酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不褪的紫色为终点。 氨基酸含量=（含有两个氨基的氨基酸，如赖氨酸、胱氨酸和精氨酸在此计算式中还应该除以2）式中：VHClO4所消耗的高氯酸标准溶液的体积 cHClO4所消耗的高氯酸标准溶液的浓度 VNaAC所消耗的醋酸钠溶液的体积 cNaAC所消耗的醋酸钠溶液的浓度 M被测氨基酸的摩尔质量 m被测氨基酸的质量,4、非水溶液滴定法,注意事项：(1)能溶解于冰醋酸的氨基酸，可以用直接法测定的有：丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨

12、酸、色氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸。不易溶解于冰醋酸，但能溶解于高氯酸可以回滴法测定的有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。(2)谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2mL 甲酸中，再加20mL 冰醋酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。,5、邻苯二甲醛法（OPT法）,原理： 邻苯二甲醛在 2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为340 和455nm。 各种氨基酸显现的荧光强度不同，其相对荧光强度由大到小大致顺序如下：天冬氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，精氨酸，组氨酸，亮氨酸，丝氨酸，缬氨酸，谷氨酸，苏氨酸，甘氨酸，色氨酸，丙氨酸，

13、苯丙氨酸，赖氨酸，酪氨酸，NH3，脯氨酸和半胱氨酸。 本法可用于测定游离氨基酸的含量。灵敏度较茚三酮法高 100 倍以上，可测到 mol氨基酸。如用于血清中-氨基氮的测定，每次血清用量只需510L。与另一种荧光试剂（萤光胺）一样，空白无荧光，只有与氨基酸结合才产生荧光。缺点是与脯氨酸不产生荧光，邻苯二甲醛与半胱氨酸荧光值太低。荧光胺已用于氨基酸自动分析定量分析，但由于试剂昂贵及个别氨基酸反应不满意，目前还未普遍应用。,5、邻苯二甲醛法（OPT法）,操作： 以血清中游离氨基酸测定为例。 血清的去蛋白处理：血清或肝素血的血浆加等体积0.6mol/L三氯醋酸，混匀，静置10min后，30004000

14、r/min离心10min。取上清液用水稀释5倍，相当于原血清的10倍稀释液。 分别吸取：每组两份。测定管：稀释10倍的血清上清液100L，加水至300L标准管：1mmol谷氨酸标准溶液25L，加0.06mol/L三氯醋酸100L。加水至300L空白管：0.06mol/L三氯醋酸100L，加水至300L。 分别加3mLOPT溶液于上述样品中，迅速摇匀，立即进行荧光测定。使用荧光分光光度计，激发光波长340nm，发射光波长455nm。,6、三硝基苯磺酸法,原理： 三硝基苯磺酸（TNBS）是定量测定氨基酸的重要试剂之一。TNBS 在偏碱性的条件下与氨基酸反应，先形成中间络合物。 中间络合物在光谱上有

15、2个吸收值相近的高峰，分别位于355nm 和420nm 附近。然而溶液一旦酸化，中间络合物转化成三硝基苯-氨基酸（TNP-氨基酸），420nm 处的吸收值显著下降，而350nm 附近的吸收峰则移至340nm 处。 利用 TNBS 与氨基酸反应的这一特性，可在420nm 处（偏碱性溶液中）或在340nm（偏酸性溶液中）对氨基酸进行定量测定。在340nm 处，各氨基酸的吸收度大致相近，而在420nm 处的吸光度因氨基酸种类而异；在加入适量 时，吸收值升高。 本法允许的测定范围是 0.050.4mol 氨基酸。,6、三硝基苯磺酸法,操作方法：偏碱性溶液，测420nm处吸光值。待测氨基酸样品溶液1mL

16、，加40g/LNaHCO3 1mL、1g/LTNBS 1mL、0.01mol/LNa2SO3 1mL，混合后于40 反应2h，在420nm处测定。空白以蒸馏水代替待测液。 标准曲线制作：标准氨基酸溶液0.10.8mL，补充水至1mL，与上述样品同样操作步骤。偏酸性溶液，测340nm处吸光值。待测氨基酸样品溶液1mL，加40g/LNaHCO3 1mL、1g/LTNBS 1mL，混合后于40 反应2h，加1mol/L盐酸1mL，混合后在340nm处测定。空白以蒸馏水代替待测液。 标准曲线制作：标准氨基酸溶液0.10.8mL，补充水至1mL，与上述样品同样操作步骤。,7、乙酰丙酮和甲醛荧光法,原理：

17、 氨基酸与乙酰丙酮和甲醛反应，生成 N-取代基2,6-二甲基-3,5-二乙酰基1,4-二氢吡啶，产生黄-绿色荧光，可用荧光分析法检测。试剂：混合试剂：取1mol/L 乙酸钠溶液10mL，加入乙酰丙酮溶液0.4mL 和30%甲醛溶液1mL，用水稀释至30mL。操作方法： 取氨基酸液 1mL，加入混合试剂1mL，用棉花塞满试管口，避光于100下加热10min，冷却，加水2mL，然后测定荧光值。 与标准相比较求出样品中的氨基酸含量。,比较：,甲醛滴定法：食品中的游离氨基酸电位滴定法：各类样品的游离氨基酸茚三酮比色法：？非水溶液滴定法：氨基酸成品的含量测定邻苯二甲醛法：游离氨基酸，比茚三酮法灵敏三硝基

18、苯磺酸法：？乙酰丙酮和甲醛荧光法：？,二、个别氨基酸的定量测定,1、赖氨酸的测定,原理： 用铜离子阻碍游离氨基酸的-氨基,使赖氨酸的-氨基可以自由地与1-氟-2,4 二硝基苯(FDNB)反应,生成-DNP-赖氨酸。经酸化和用二乙基醚提取,在波长390nm 处有吸收峰,从而求出样品中游离赖氨酸的含量。,1、赖氨酸的测定,操作方法：向各烧瓶中加入25mL 磷酸铜悬浮液，然后再加10%丙氨酸1.0mL,振摇15min。吸取10%FDNB 溶液0.5mL.置于各处理烧瓶中,将烧瓶置沸水中加热15min。 取出烧瓶,立即加入1mol/LHCl 溶液25mL,并不断摇动使之酸化和分散均匀。 烧瓶中的溶液冷

19、却至室温,用水稀释至100mL.取约40mL 悬浮液进行离心。 用25mL 二乙基醚提取上清液3 次，除去醚。并将溶液收集于有刻度试管中,于65 水浴中加热15min，以除去残留的醚。并记录溶液的毫升数。吸取上述各处理液10mL，分别与95%乙醇溶液10mL 混合，用滤纸过滤。用试剂空白液凋零，测定样液A390nm，与赖氨酸-HCl 标准液对照，求出样品中赖氨 酸-HCl 的含量。 本法在 040mg/L 赖氨酸溶液范围内呈良好线性关系。,1、赖氨酸的测定,说明： 添加一定量的中性氨基酸如丙氨酸，增加总氨基酸的浓度，有助于赖氨酸-HCl 浓度 具有良好的线性关系。 用醚提取酸性溶液，可将所有中

20、性或酸性的DNP-氨基酸衍生物除去，并把FDWB 的产物破坏，否则这些产物在390nm 处存在干扰。,2、色氨酸的测定,原理 ：样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生 成哈尔满化合物（norharman），具有特征荧光值，可以进行定量测定。试剂：(1)0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸溶液：称取三氯化铁(FeCl36H2O)41mg，加入10%三氯乙酸溶液溶解并定容至500mL。 (2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%38%)5.5mL，加水至100mL。 (3)色氨酸标准溶液：称取10mg色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL,

21、 置棕色瓶中备用,使用时用水稀释成1mg/L的标准溶液,2、色氨酸的测定,操作方法： 称取样品粉末100200mg于离心管中，加入4mL乙醚,摇匀后过夜，以3000r/min速度离心。将乙醚提取液移入试管内,并用乙醚洗涤残渣3次，收集乙醚液于试管中，于40水浴除去醚。残留物中加入6.25mol/L NaOH4mL，火焰封口，于110水解1624h。水 解液用4mol/L HCl 溶液调节至pH68 后,用水定容至50mL,过滤备用。 吸取滤液0.2mL，加入2%甲醛0.2mL和0.3mmol/L三氯化铁-三氯乙酸混合液2mL，摇匀后于100水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至10mL。在激发

22、波长为365nm，发射波长449nm条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含量。 本法在010mg/L色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。,3、苯丙氨酸的测定,原理：苯丙氨酸与茚三酮及铜盐反应生成荧光复合物，其荧光复合物在激光波长365nm、发射波长490nm处可以产生最大荧光强度，与标准氨基酸对照，可求出样品中苯丙氨酸的含量，检测时加入L-亮氨酸-L-丙氨酸二肽能增强这一反应。,试剂（1）二肽茚三酮试剂试剂 A：5mmol/L 亮丙二肽溶液：称取 L亮氨酸L丙氨酸 1mg 溶于 1mL 水中 ，临用时配制。试剂 B：30mmol/L 茚三酮溶液：称取茚三酮 534mg

23、溶于 100mL水中，冰箱内贮存。试剂 C：0.6mol/L 琥珀酸盐缓冲液：称取琥珀酸 7.086g，加水约 25mL，加入4.8mol/LNaOH 溶液调至 pH5.88，加水至 100mL，冰箱内贮存。 临用前将试剂 A、B、C 按 1+2+5 体积比混合。（2）铜试剂试剂 A：25mmol/L 碳酸钠0.4mmol/L 酒石酸钾钠溶液：称取无水碳酸钠2.66g、酒石酸钾钠（含 4 份结晶水）113mg 加水至 1000mL。试剂 B：0.8mol/L 硫酸铜溶液：称取硫酸铜（CuSO45H2O）100g，溶于 500mL水中。 临用前将试剂 A、B 两液按 3+2 体积比混合。（3）苯

24、丙氨酸标准溶液：称取苯丙氨酸配制成6.6mg/L氨基酸标准溶液。,3、苯丙氨酸的测定,3、苯丙氨酸的测定,操作方法：血清的去蛋白处理：吸取新鲜血清50100uL和等体积0.6mol/L三氯乙酸溶液混合，静置10min后，以4000r/min速度离心10min，吸取上清液用水精确稀释5倍。样品测定：吸取血清稀释液100uL置于样品管中，另吸取苯丙氨酸标准液25uL，加0.06mol/L三氯乙酸溶液100uL，然后两管均加水至200uL，同时作试剂空白分析。再向各管加入 0.3mL 二肽茚三酮试剂。放在75水浴中保温80min。取出冷却，加入2.5mL铜试剂，振摇均匀，90min内在激发波长为38

25、5nm、发射波长472nm条件下，测定样品的荧光值，与苯丙氨酸标样作对照，求出样品游离苯丙氨酸的含量。,4、酪氨酸的测定,原理： 酪氨酸和1-亚硝酸-2-萘酚反应，生成有色化合物，此化合物在硝酸和亚硝酸钠存在的条件下加热，产生稳定的荧光物质，可用荧光法定量测定。操作方法：样品去蛋白处理：吸取新鲜血清50100uL和等体积0.6mol/L三氯醋酸溶液混合，4000r/min离心10min，吸取上清液用水精确稀释5倍，即得稀释10倍的样品溶液。样品测定：分别吸取样液100uL于具塞试管1；标准酪氨酸溶液25uL和0.06mol/L三氯醋酸溶液100uL于具塞试管2,0.06mol/L三氯醋酸溶液1

26、00uL于具塞试管3，各管用水补充容积至200uL。 将各管置于55水浴数分钟，加入新配制的亚硝酸萘酚试剂0.3mL，摇匀，55保温20min，保温后加水2.5mL，摇匀后再加三氯乙酸溶液3mL。充分振摇以便将多余的试剂抽提入二氯乙烷溶液中，4000r/min离心10min，将上层水溶液移至另一试管内，在180min内，于激发波长为468nm、发射波长为555nm处，测定样品的荧光强度，与氨基酸标样对照，求出样品氨基酸含量。 本法在00.2mol/L酪氨酸范围内呈良好的线性关系。,5、脯氨酸的测定,原理： 在丙酮溶剂中，脯氨酸与吲哚醌反应形成蓝色化合物，能用以测定蛋白质水解液中的脯氨酸含量，在

27、一定条件下，可以在其他氨基酸存在下直接进行测定，不受羟脯氨酸的干扰。试剂：pH3.9柠檬酸盐缓冲液；0.75g/L吲哚醌丙酮溶液；水饱和酚溶液。操作方法： 称取蛋白质样品5mg，加6mo1/L HCl溶液2mL，封管后于140水解4h。启封，加蒸馏水稀释至盐酸浓度达0.25mo1/L。 吸取蛋白质酸水解液0.100.50mL于小烧杯内，75干燥至恒重。残留物加pH3.9柠檬酸缓冲液0.20mL，使残留物完全溶解后，加0.75g/L吲哚醌丙酮溶液0.25mL混匀，于100烘箱内使溶剂蒸发0.5h左右。在避光条件下，加入0.50mL水饱和酚溶液，剧烈摇动，加1mL蒸馏水和2mL丙酮混匀，立即在波长

28、598mn条件下，以试剂空白调零，测定样品的吸光度A。与氨基酸标准对照，求出样品中脯氨酸的含量。,6、羟脯氨酸的测定,6、羟脯氨酸的测定,7、胱氨酸的测定,操作方法：从4支试管中分别吸取：a.测定管：样品液1.0mLb.样品空白管：样品液1.0mLc.标准管：胱氨酸标准液0.5mL、蒸馏水0.5mLd.试剂空白管：蒸馏水1.0mL胱氨酸的还原反应：上述各管分别加入醋酸盐缓冲液1.0mL、亚硫酸钠试剂0.3mL。测定管和标准管各加入蒸馏水1.7mL；样品空白管和试剂空白管各加蒸馏水1.5mL、0.1mol/LHgCl2溶液0.2mL，混合后放置2min。巯基的还原反应和比色：上述各管分别加磷钨酸

29、试剂1.0mL，混合后于15min内，在600nm波长下，以试剂空白管校正零点，测定标准管吸光度；以样品空白管校正零点，测定样品测定管吸光度，与氨基酸标样作对照，求出样品氨基酸含量。 本法在0200mg/L氨基酸范围内呈良好的线性关系。,7、胱氨酸的测定,操作方法：取样品稀释液1mL于反应瓶主室中，其中再加0.2mLpH4.8醋酸盐缓冲液、1mL蒸馏水，在反应瓶侧室内加入0.3mL大肠杆菌丙酮粉悬浮液。装瓶密封，固定在振荡板上放入37恒温水浴。旋调检压液达260nm左右，振荡，与外界平衡五分钟，关闭上端三向阀门与外界隔闭，旋调检压液至150nm处，再振摇五分钟，调准检压液闭口端至150mm处，记下开口端检压液高度，此为初读。记下初值后，迅速将侧室中酶液倒入反应液中，振摇1015分钟。旋调检压液闭口端至150mm处，记下开口端检压液高度，此读数减去初读数再加上或减去空白瓶差额即为压差V。,谢谢欣赏！,