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1、流式细胞术实验方法及应用何 玉 萍,科研型 分选功能488nm激光 四色荧光(525、575、610、675nm）,一、流式细胞术的原理,流式细胞仪的发展起源于细胞计数自动化的研究。其原理是被荧光染色的单细胞或颗粒，经过高速的液流系统形成细胞柱，排列成单细胞依次通过流动室，在激光照射区域，携带荧光素细胞受激发产生不同的荧光信号，这些荧光信号可以反映细胞的生物特性。,前向散射,激光,FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,近30年来流式细胞术在我国得到很快的发展，应用范围不断增大。目前，流式细胞术作为一门生物检测技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化
2、学等临床医学和基础医学研究领域。,二、流式细胞术的特点、优点,速度快极短时间内可分析大量细胞，每秒可检测上万个细胞，甚至几万个细胞。多参数分析可同时分析单个细胞的多种特性，获得单个细胞多种信息，也可以根据其细胞表面标志的不同把细胞群分为各亚群。,定性、定量分析细胞通过荧光染色对单细胞的某些成分，如：DNA、抗原或受体等进行定性、定量分析。 灵敏度高 荧光能检测到单个微粒上标有荧光分子少于600个 (如FITC或PE)；前向角检测到小于0.3um颗粒。 分选感兴趣的细胞 纯度达99%，收获率可达90%。,流式细胞术的应用范围细胞大小细胞表面分子:CD系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P
3、53细胞功能检测:细胞周期、细胞凋亡其他：线粒体膜电位、细胞内钙离子浓度,常用荧光素,三、单克隆抗体标记荧光探针选择1.了解激发光波长和发射波长,2. 要有高的光子产量-提高信号强度。3. 对激光有强的吸收-降低背景噪音。4. 激发光谱和发射光谱之间差距大-减少 干扰。5. 易与被标记的物质结合，而不影响被标记 物的特异性。6. 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂 和固定剂等影响。,常用荧光探针组合,细胞表型分析： 双色分析：FITC与PE 三色分析：双色分析+PE-CY5 四色分析：三色分析+ECDDNA含量分析： PI 凋亡与坏死分析： 凋亡用Annexin V-FITC/PI双染,四、
4、标本的收集、单细胞悬液的制备 骨髓、外周血、细胞株、组织器官、 胸水、腹水、尿液脱落细胞等,1、骨髓及外周血细胞单细胞悬液的制备 骨髓及外周血都是天然的单个细胞，可直接标记，再溶血。,单细胞的分离制备 分离液 血液+生理盐水 离心 2500r/min，20-30min 单个核细胞,单核细胞: 利用单核细胞在短时培养贴壁快的特性（30-40min），可采用短时培养获得较纯的单核细胞.,2、培养细胞样品的制备(贴壁细胞) 培养板 吸去培养液 PBS洗2次 胰蛋白酶 37，室温，3-5min 含血清的培养基 吹打 PBS洗2次 单细胞悬液。,3. 组织器官单细胞悬液的制备 酶消化法 组织器官 单细胞
5、制备仪 剪碎法 机械法 网搓法 研磨法,（1）、酶消化法组织块洗去血液 剪成小块 胰蛋白酶 37，15-30min 含血清的培养基 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。,（2）、机械法 单细胞制备仪 组织块洗去血液 剪成小块 制备仪 2-3min 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 剪碎法 组织块洗去血液 剪至浆状 吸管轻轻吹打 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。,网搓法 组织块洗去血液
6、100目钢筛网轻搓 生理盐水 收集滤液 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液。 研磨法 组织块洗去血液 研磨器研至匀浆 100目钢筛网 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS洗2次 单细胞悬液。,4. 石蜡包埋组织单细胞悬液的制备,醇乙脱水：7080%90 95% 100%醇乙二甲苯石蜡包埋脱蜡水化：二甲苯脱蜡 100醇乙90%80%7050蒸馏水,手术获得的新鲜实体组织，常要送病理石蜡包埋处理，这些标本也可用于流式细胞术的检测。,石蜡包埋组织制备单细胞悬液 石蜡包埋组织切片 二甲苯脱蜡 1-2天 水化 乙醇，蒸馏水 组织器
7、官 胰蛋白酶 37，15-30min 冰PBS 100目钢筛网过滤 300目尼龙网过滤 离心 1000r/min，5min PBS 洗2次 单细胞悬液,5. 脱落细胞单细胞悬液的制备包括： 尿液脱落细胞 胸水、腹水脱落细胞 冲洗液脱落细胞,收集胸水、腹水、尿液、冲洗液 置 4 冰箱中 沉淀 取底部10-20ml PBS洗 3 次 300目尼龙滤网过滤 单细胞悬液收集方法、沉淀时间胸水、腹水：胸、腹水50-100ml，加入1000U/ml 肝 素液，置于4 冰箱中静置 6-12h尿 液：收集24h 尿液，置4冰箱中自然沉淀 2h冲洗液：300-500ml 生理盐水冲洗膀胱 ，冰箱内置 6-12h
8、,五、荧光标记 主要包括间接免疫荧光染色和直接免疫荧光染色两种方法。 间接标记是采用特异的无荧光标记的一抗与待测标本反应后，洗去未结合抗体再加入荧光标记的二抗，形成有荧光的抗原-抗体-抗体复合物。其操作复杂、费时，目前很少用。在科研中需要一些新的抗体没有直接抗体，只能采用此方法。 直接标记是在标记时加入连接着荧光素的特异性抗体，该方法简单，目前广泛应用于各实验室。,羊抗兔兔抗小鼠 小鼠,直 标,间 标,根据细胞部位的不同，可分为细胞表面和细胞内抗原染色，细胞内标记需要固定、破膜等步骤 1.细胞表面抗原的标记法（外周血为例 ） 全血50ul（5105）+10ul相应抗体避光孵育15-30min
9、溶血素 室温10min PBS洗1次 上机分析（1% 多聚甲醛固定）。,2. 细胞浆或核内抗原标记法 收集单细胞悬(1106)+固定剂A 室温，15 min洗涤去固定液 破膜剂B及抗体 室温，15 min PBS洗涤1次 上机分析（1% 多聚甲醛固定）。 3. 细胞表面和细胞内抗原同时标记 在流式分析中通常需要细胞膜表面和细胞内同时标记，首先标记表面抗原，然后再对细胞膜和核膜进行固定破膜后再标记胞内或核内抗原。 常见细胞破膜剂： 0.05%皂角素、0.1%曲拉通 (Triton X-100)、70%乙醇、 商品化固定破膜剂（A、B）。,1、空白对照 用缓冲液（PBS）代替单克隆抗体进行实验2、
10、阳性染色对照 用现有试剂和方法检测已知表达某种特异性抗原的细胞即为阳性细胞。如检测血小板CD62P时，可用被ADP诱导活化血小板作为CD62P检测的阳性对照细胞。,六、荧光染色对照设置(空白对照 、阳性对照、阴性对照、 同型对照 ),3.阴性染色对照已知不表达某种抗原的细胞即为阴性细胞群，如CD3/CD19双染检测健康人血液淋巴细胞亚群时，应有一群不表达这两种抗原的双阴性细胞群（主要是NK细胞），可作阴性对照。4. 同型对照 与染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型，如IgG-FITC、IgG-PE,七、荧光补偿,流式细胞分析中常需要两种或两种以上不同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由
11、于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补偿。,八、数据分析 流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意门和四象门等。,任意门、矩形门 线性门 四象门,多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。,淋巴细胞,T淋巴细胞（CD3+）,CD3+CD8-,IF
12、N-r,IL-4,（CD4+）,数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为单参数直方图和双参数散点图。,参数的意义:FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，散射光越强，细胞越小,散射光越弱;SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反映细胞颗粒性程度大小。单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数；双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度.,SSC,FSC,九、流式细胞术的应用及标记方法,1、DNA含量分析 意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的增殖状态及细胞周期分布。 正常生物细胞，DNA
13、含量随着细胞增殖周期时相而发生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C4C） G2/M期（4C）。,2C,2C4C,4C,FCM进行细胞周期DNA含量分析时，需要对DNA进行染色，DNA染料（PI）与DNA结合具有特异性，有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比。FCM分析一个 细胞群周期与DNA倍 体时，将DNA含量直 方图分为三部分， 即G0/G1、S、G2/M 三个细胞峰。,G2/M(4C),G0/G1(2C),S(2C4C),G2/M(4C),方法： 细胞悬液（1*106） 70%冰乙醇 4C ，24h 离心去固定液 PBS洗2
14、次 RNase 30min PBS洗1次 PI 避光,30min 上机采集10000细胞，MultiCycle软件进行细胞周期分析,G0/G1(2C),S(2C4C),G2/M(4C),当人体癌变或者具有恶性潜能的癌前病变时，在其发生、发展过程中可伴随有细胞DNA倍体及S期的改变（异倍体） 恶性肿瘤细胞增殖周期的判断： S10、G2/M15或S20、G2/M5,2、 淋巴细胞亚群分析,白细胞分化抗原（CD分子）的命名：1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群(Cluster of Differentiati
15、on，CD)，进行编号、命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个分化抗体群被鉴定并命名,流式细胞结合单克隆抗体技术能准确分类计数淋巴细胞亚群，被认为是血液中淋巴细胞免疫表型分析的标准方法。血液淋巴细胞是一群特异性极强的细胞，根据淋巴细胞的功能及膜表面标志，主要分为T淋巴细胞(CD3+)、B淋巴细胞(CD19+)、NK细胞(CD16+56+/CD3-)三个亚群。,CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,T淋巴细胞（CD3+）淋巴细胞 B淋巴细胞（CD19+） NK细胞（CD16+56）+,NK细胞:CD(16+56)+/CD3-,B淋巴细
16、胞:CD19+/CD3-,NK+/CD3-,CD（16+56）+/CD3+（T-cell）,CD19+/CD3+（T-cell）,CD19+/CD3-,外周血淋巴细胞亚群标记方法（表面标记）,50ul+10ul相应抗体 避光孵育15min 加OptiLyes C溶血素250ul 室温10min PBS洗一次 上机分析抗体: CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CY5三标抗体CD19-PE/CD3-FITC二标抗体CD16+56-PE/CD3-FITC二标抗体IgG-FITC/IgG-PE/IgG-PE-CY5同型对照,淋巴细胞亚群检测临床意义： CD3+、CD4+、CD8+总数降低：
17、细胞免疫功能低下 CD4+（CD4+/CD8+）降低或CD8+(CD8+/CD4+)升高：AIDS、病毒感染、恶性肿瘤（复发或转移）、再生障碍性贫血等 CD4+(CD4+/CD8+)升高或CD8+(CD8+/CD4+)降低：自身 免疫性疾、多发性硬化病、自身免疫性溶血性贫血 CD3+CD4+CD8+T细胞减少：见于免疫球蛋白缺乏症、胸腺发育不良、严重免疫缺陷病。,NK CD(16+56) + 活性低下：肿瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等 NK+ CD(16+56) + 活性增高：多发性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（B病毒、疱疹病毒、肺TB）、习惯性流产等 CD19+B细胞减少：体液免疫
18、抑制 CD19+B细胞增高：B细胞恶性增殖性疾病（白血病）,3、 白血病免疫分型,FCM作为白血病辅助诊断，免疫分型是急白血病诊断的关键技术。利用不同类型的白血病具有不同抗原表达的特异性进行分型：髓系、B淋巴系、T淋巴系、非系列特异性等。标记方法：往往需要胞浆和胞膜同时标记，一线抗体包括：胞浆（髓系-MPO，B淋巴系-CD79a, T淋巴系-cyCD3）,胞膜(髓系-CD13、CD117，B淋巴系-CD19、CD10, T淋巴系-CD3、CD2)等,采用CD45和侧向散射(SSC）设门技术可将各细胞群分开，荧光从强大到弱：淋巴细胞群单核细胞成熟粒细胞原/幼细胞(白血病细胞)，而成熟的红细胞和血
19、小板不表达。,正常骨髓流式细胞分布图,各系表达的抗原造血干细胞：CD34、CD33髓系表达 ：CD13、CD14、CD33巨核细胞 ：CD61、CD41B细胞系：CD10 、CD19、CD20T细胞系：CD2、CD3、CD5、CD7NK细胞: CD16、CD56、CD57,4、细胞因子的检测,细胞因子（CK）主要由免疫细胞产生，也可由非免疫细胞如内皮细胞、成纤维细胞等产生。一种细胞可产生多种CK，一种CK也可由多种细胞产生。细胞因子分为4类：白细胞介素（lL）；干扰素（IFN）；造血生长因子；肿瘤坏死因子（TNF）。,血液中未活化的白细胞内无或仅极小量细胞因子，当其被各种激活剂活化后，细胞内细
20、胞因子合成增加并不断分泌到细胞外而发挥作用。因此，要测定细胞内的细胞因子较为困难。通常应用刺激剂（如：佛波脂）来刺激细胞因子分泌 ，同时加入一定浓度的细胞内蛋白分泌抑制剂（如：莫能霉素），使细胞因子合成后累积在细胞内，通过细胞因子特异的单克隆抗体进行细胞内荧光染色，并结合膜表面抗原染色，进行多色分析各种细胞内合成的细胞因子。,细胞因子检测（IFN-r ，IL-4）：,全血或单细胞+刺激素(佛波脂)和阻断剂(莫能霉素) 37培养4-6h 加入细胞表面抗体(如CD3、CD4/CD8) 孵育20-30min PBS洗1次 加固定破膜剂 室温15min 加入IFN- r和IL-4抗体 孵育30min
21、PBS洗两次 FCM。,结果分析：运用流式设门技术，先利用前向散射（FS）和侧向散射（SS）圈出淋巴细胞，再用CD3+和SSC设门圈出T淋巴细胞，再用CD8-/CD3+设门选定T淋巴细胞亚群，再分析IL-4+和CD4+/IFN-r,淋巴细胞,T淋巴细胞（CD3+）,CD3+CD8-（CD4+）,IFN-r,IL-4,5、细胞内Ca2+浓度Ca2+超载是细胞损伤的重要标志，导致DNA降解，促使细胞凋亡。,检测 Fluo-3/Am是高特异性Ca2+荧光指示剂，能与Ca2+特异结合。Fluo-3它本身是亲水性，不易透过膜的，依赖其脂溶性AM（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨过质膜进入胞浆，在胞内酯酶的作
22、用下，脱去AM重新生成亲水性形式，一方面不能再进入细胞器，另一方面易于在胞内扩散，与游离钙离子结合，通过检测其荧光强度可反映出细胞内游离Ca2+浓度的变化。 单细胞悬液+flour-3/AM 37C避光孵育40min PBS洗1次 上机检测,6、线粒体膜电位,线粒体膜电位（MMP）是线粒体功能的重要参数，是评价线粒体功能的敏感指标，它的大小直接反映线粒体功能及数量，MMP下降，其氧化磷酸化功能障碍，使ATP产生减少，导致细胞凋亡和坏死。,MMP检测原理及方法：,Rhodamine123（罗丹明123）、DiOC6、JC-1等多种亲脂性的阳离子荧光素都能被流式细胞分析用于作为检测 MMP的探针。
23、这些亲脂性荧光染料，对膜具有通透性，另外线粒体内外膜之间存在着跨膜电位，线粒体内膜的内侧带负电荷，当它们与活细胞一起培养时，这些阳离子荧光素进入细胞内就能特异地聚集于线粒体，其摄入量与线粒体膜电位成正比。,当MMP降低后，线粒体内的荧光素会发生外漏，在细胞内荧光强度降低。检测其荧光强度能反映线粒体数量和MMP的降低或丧失。操作：单细胞悬液（1*10 6 ）+1umol/L的Rh123 37 C,30min PBS洗两次 上机检测,7、 FCM检测细胞凋亡,细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序结束其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的
24、调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。,（1） Caspase家族,半胱氨酸蛋白酶（Caspase）以无活性的酶原形式存在细胞内，需被水解加工后才能成为有活性的片段。活化的Caspase进一步激活其他的Caspase前体，形成了级联放大切割过程，是直接导致凋亡细胞解体的蛋白酶系统，目前已发现15个Caspase家族成员，分别命名为Caspase1-15。在Caspase家族成员中，Caspase-3是最重要的指示蛋白酶。,操作：单细胞悬液（1*10 6） 固定和破膜剂 冰浴20min Perm/Wash Buffer洗两次 20ul单抗 室温孵育30
25、min Perm/Wash Buffer洗1次 加0.5ml Perm/Wash Buffer 上机检测。,（2） 凋亡相关基因蛋白,细胞凋亡过程中有多种基因蛋白参与调控。凋亡相关基因可分两类：诱导凋亡基因和抗凋亡基因。主要有bcl-2家族、P53、 ced基因家族等。 抗凋亡基因:bcl-2、bcl-XL、Bad 等 促凋亡基因:bax、bak、bcl-XS等 染色标记同Caspase,（3）Fas/FasL,Fas又称APO-1，即CD95分子，是细胞膜上的跨膜蛋白，表达在各种组织细胞，是典型的细胞死亡受体。Fas/FasL是凋亡诱导家族的重要成员之一，是调节组织发育和体内平衡的重要分子,
26、Fas/FasL结合,可向细胞传递死亡信号,引起细胞凋亡。 检测：同表面标记,（4） 凋亡率检测,被认为比较成熟的方法：,PI单染色法Annexin VPI双染法。TUNEL法,碘化丙啶（PI）单染法（DNA周期分析）：由于凋亡细胞DNA被降解，小分子DNA可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分DNA，造成凋亡细胞DNA含量减少，与荧光染料结合减少，荧光强度减弱，在DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。,Annexin VPI双染法：在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层
27、翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征，PS被特异的Annexin V-FITC探针所标记，而PI对细活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，故Annexin V-FITC/PI双染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。,机械损伤细胞： Annexin V -/PI+ 晚期凋亡、坏死细胞：Annexin V +/PI+早期凋亡细胞： Annexin V +/PI-活细胞： Annexin V -/PI-,TUNEL法：细胞凋亡时，双链DNA会出现断裂点，即产生一系列3 端。在脱氧核糖核酸转移酶(TdT)催化的反应下，能将荧光素-脱氧尿苷三磷酸(dUTP) 标记到断裂的DNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。,FCM的临床检测项目,HLA-B27淋巴细胞亚群（CD3、CD4、CD8、CD16+56、CD19）白血病免疫分型（CD2、CD3、CD13、CD14、CD33、CD34、CD117、CD79a、cCD3、MPO等）阵发性血红蛋白尿（CD55、CD59）血小板活化指标（CD62P、CD63）细胞周期分析,谢谢！,
