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1、,液相色谱基础及方法开发,2013年5月7日,主要内容,一 液相色谱基础知识,液相色谱法：利用组分在两相间分配系数不 同而进行分离的技术移动相：携带样品流过整个系统的流体固定相：静止不动的一相-色谱柱,色谱分离的机理,色谱是一种分离技术色谱分离是一个物理过程,流动相（Mobile Phas）固定相（Stationary Phase）样品（溶解于流动相中的溶质）,液相色谱分离机理,高效液相色谱是一种以液体作流动相和固体微粒作固定相，待测组分在柱内的两相之间进行高速分配和高效分离的柱液体色谱方法。 样品溶液中的各组分，因其物理化学性质的微小差异，当其随流动相进入色谱柱后，便在柱的两相之间产生不同的
2、相互作用力，从而导致柱上迁移速率的微小差异。 随着流动相的连续推移，这种微小的差异被不断扩大，直至柱内出现明显不同的迁移距离，使最终达到组分完全分离。,液相色谱的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,泵输液,分离柱,检测器,记录,进样阀,进样,HPLC的仪器配置,色谱泵,色谱柱及柱温箱,检测器,数据处理系统,溶剂,自动进样器,液相色谱图相关术语,色谱图(chromatogram)样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时 间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 基线(base line)经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
3、噪音(noise)基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。峰底基线上峰的起点至终点的距离。 峰高(peak height，h)峰的最高点至峰底的距离。 峰面积(peak area，A)峰与峰底所包围的面积。,液相色谱图相关术语,色谱峰(peak)组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线。流出曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。不对称色谱峰有两种：前延峰(le
4、ading peak)和拖尾峰(tailing peak)。拖尾因子(tailing factor，T) 是用以衡量色谱峰的对称性，也称为对称因子(symmetry factor)或不对称因子(asymmetry factor)。中国药典规定T应为0.951.05。T0.95为前延峰，T1.05为拖尾峰。峰宽(peak width，W)峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)峰高一半处的峰宽。标准偏差(standard deviation，)正态分布曲线x1时（拐点）的峰宽之半。正常峰的拐点在峰高的0.607倍处。
5、标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。小，分散程度小、极点浓度高、峰形瘦、柱效高；反之，大，峰形胖、柱效低。,液相色谱图相关参数,定性参数（保留值）柱效参数相平衡参数 容量因子k 选择性因子a分离参数,定性参数（保留值）,死时间(dead time，t0)不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通 过色谱柱的时间。 死体积(dead volume，V0)由进样器进样口到检测器流动池未被固定相 所占据的空间。V0Ft0（F为流速） 保留时间(retention time，tR)从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。 保留体积(retention volume，VR)从进样开
6、始到某组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VRFtR。 调整保留时间(adjusted retention time，tR)扣除死时间后的保留时间。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR只决定于组分的性质，因此，tR（或tR）可用于定性。tRtRt0 调整保留体积(adjusted retention volume，VR)扣除死体积后的保留体积。VRVRV0或VRFtR,柱效参数,理论塔板数(theoretical plate number，N)用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。 N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及
7、测定柱效所用物质的性质。如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为： N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组分含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）,相平衡参数,容量因子(capacity factor，k)化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的量之比。因此容量因子也称质量分配系数。 性质-与柱子的大小及流速无关,只与溶质在固定相和流动相的分配性、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体积比）有关。
8、 范围 0.4k2030,相平衡参数,选择性因子(selectivity factor，)相邻两组分的分配系数或容量因子之比。 要使两组分得到分离，必须使1。与化合物在固定相和流动相中的分配性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本质上来说，的大小表示两组分在两相间的平衡分配热力学性质的差异，即分子间相互作用力的差异。,分离参数,分离度(resolution，R)相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。也叫分辨率，表示相邻两峰的分离程度。,分离参数,基本分离方程影响分离度的因素很多，但可慨刮为三个基本项,(a)柱效项。(b)柱选择性项(c)柱容量因子项。即： 从基本分离方程可看出，提高
9、分离度有三种途径：增加塔板数。方法之一是增加柱长，但这样会延长保留时间、增加柱压。更好的方法是降低塔板高度，提高柱效。增加选择性。当1时，R0，无论柱效有多高，组分也不可能分离。一般可以采取以下措施来改变选择性：a. 改变流动相的组成及pH值；b. 改变柱温；c. 改变固定相。改变容量因子。这常常是提高分离度的最容易方法，可以通过调节流动相的组成来实现。k2趋于0时，R也趋于0；k2增大，R也增大。但k2不能太大，否则不但分离时间延长，而且峰形变宽，会影响分离度和检测灵敏度。一般k2在110范围内，最好为25。,二 液相色谱方法开发过程,1. 得到样品信息，确定分离目标2. 确定特定的液相过程
10、、样品预处理等需求3. 选择合适的检测器4. 初步分离，优化分离条件5. 检测特定过程的问题及需求，优化分离条件,检测器种类,紫外吸收 紫外吸收检测器 光电二极管阵列检测器荧光示差折光化学发光,紫外吸收检测器,紫外吸收检测器常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽(190nm800nm)。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用，光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信
11、号输出，输出信号大小与组分浓度有关。 局限：流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能做流动相，每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。,色谱基本分类,色谱基本分类： 按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以分为： 1.分配色谱分配系数 2.亲和色谱亲和力 3.吸附色谱吸附力 4.离子交换色谱离子交换能力 5.凝胶色谱（体积排阻色谱）分子大小引起的体积排阻,分配色谱,分配色谱分为： 正相色谱：固定相（填料）为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相（填料）为非极性，流动相为极性
12、，极性高的先被洗脱，用得最多，约占60-70%。 相对应的色谱柱： 反相柱：烷基硅烷键合硅胶填料，如C18（ODS）、C8、C4、C3、苯基等。 正相柱：典型的为硅胶柱，其它官能团为-CN氰基，-NH2氨基等。,分配色谱的分离机理,流动相极性,流动相洗脱强度,反相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 水 甲醇乙腈 乙醇丙醇异丙醇四氢呋喃 最常用的流动相组成“甲醇-水；乙腈-水”正相色谱最常用的流动相及其洗脱强度： 正己烷乙醚乙酸乙酯异丙醇,方法开发的具体步骤,先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能纯度高的标准品先用高强度的洗脱液调节k值改变保留值调节a值改变选择性通过改变流动相的pH值，使样
13、品成中性加入“对离子”，使样品呈中性调节柱长度改变柱效及分离速度,三 液相色谱方法开发实例,实例一：色谱条件色谱柱：C18，4.6mm150mm流动相：乙腈/水，乙腈从100%逐渐降低（或走梯度） 举例中用不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60， 由强渐弱 流速：1ml/min样品： 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben),1.改变容量因子 K,谱图,2.调节值改变选择性,同样强度的不同溶剂，改变了流动相值,改变色谱柱,液相色谱方法开发实例,实例二（正相系统）色谱条件：流动相
14、：正己烷（含三氟乙酸0.1%）：异丙醇=70：30,液相色谱方法开发实例,流动相：正己烷：异丙醇：三氟乙酸=80：20：0.1,液相色谱方法开发实例,流动相：正己烷：（异丙醇：乙醇=70：30）三氟乙酸=72：28：0.1,液相色谱方法开发实例,实例三（正相系统）,流动相：正己烷：乙醇：三氟乙酸=98：2：0.1,正己烷：异丙醇：三氟乙酸=98：2：0.1,液相色谱方法开发实例, 实例四（反相系统）梯度程序（A：甲醇 B：水） T（min） A% B% 0 35% 65% 4 35% 65% 4.1 56% 44% 21 56% 44% 21.1 35% 44% 30 35% 68%,液相色谱方法开发实例,流动相A: 水：磷酸=1000：1 流动相B：乙睛：磷酸=1000：1 时间(min) 流动相A% 流动相B% 0.01 10 90 3.00 10 90 43.00 50 50 43.10 90 10 50.00 90 10,Thank You !,由于本人学术水平有限，本文可能会有很多缺点和不足，诚恳诸位领导、同事给予批评和指正。,
