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1、环介导等温扩增技术,Principle of Loop-mediated isothermal amplification,环介导等温扩增法为已知基因的检测提供“简便、快速、准确、廉价”的基因检测方法,什么是环介导等温扩增？,环介导等温扩增,环介导等温扩增是“Loop-Mediated Isothermal Amplifi-cation”的简称，是一种“简单、快速、准确、廉价”的基因扩增方法。 环介导等温扩增的特征是针对目标DNA链上的6个区段设计4个不同的引物然后再利用链置换型DNA合成酶在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型DNA合成酶、基质等共同置于一定温度下（60-
2、65），经一个步骤即可完成。其扩增效率极高，可在1560min内实现1091010倍的扩增。而且由于有着高度的特异性，只需很据扩增产物的有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断。,环介导等温扩增有哪些优点？,优点,不需要使双链DNA先变性成单链，省时。,扩增反应在等温下可持续进行。,扩增的效率极高。,针对6个区段使用4种引物，拥有高度的特异性。,不需要PCR仪器，仅仅使用一种链置换型DNA聚合酶，成本低廉。,扩增产物是在同一条DNA链上互补序列周而复始形成大小不一的片段，检测方法简单。,环介导等温扩增引物如何设计？,引物的设计,首先在靶基因的3末端设定F3c、F2c、F1c三个区段，在5末端设定
3、B1、B2、B3三个区段，针对这6个区段可以设计4个引物。,3,5,3,5,F3c,F2c,F1c,B1,B2,B3,B1c,B2c,B3c,F3,F2,F1,Target DNA,FIP,F3 Primer,BIP,B3 Primer,F1c,F2,3,5,F3,5,3,5,3,5,3,B2,B1c,B3,FIP: FIP引物在3末端含有与F2c互补的F2区段，在5末端含有与F1c相同序列的区段。F3 Primer: F3引物含有与目标DNA上的F3序列相同的区段。BIP: BIP引物在3末端含有与B2c互补的B2区段，在5末端含有与B1c相同序列的区段。B3 Primer: B3引物含有与
4、目标DNA上的B3序列相同的区段。,环介导等温扩增引物如何设计？,引物设计要点,关于各引物的设计，需要专门的支持软件：Primer Explorer。设计中需特别注意碱基组成、GC含量、二次结构等问题。,F2、B2、F3、B3的3末端应极力避免AT碱基连续或过多。,扩增领域为F2B2区段间，引物应该在200bp以内。,包含F2/B2在内的环状部分的长度在4060bp范围内。,各区段的Tm值应该在6065之间。,若只是为了鉴定靶基因存在与否，F1-B1的间距可以为零。,引物应避免二次结构发生。,各引物的3端不可含有与其他引物互补的序列。,具体引物设计信息请参照网页：http:/primerexp
5、lorer.jp/e/,（1）,（2）,（3）,（4）,（5）,（6）,（7）,（8）,解离链,解离链,哑铃状模板构造形成的过程,FIP,BIP,F3 Primer,B3 Primer,环状结构,环状结构,环状结构,循环扩增阶段和延伸循环阶段,环介导等温扩增反应的体系,环介导等温扩增法所需的试剂,模板DNA,DNA扩增,引物 FIP F3 BIP B3,链置换型DNA聚合酶,dNTPs,反应缓冲液,模板DNA,RNA扩增,引物 FIP F3 BIP B3,链置换型DNA聚合酶,dNTPs,反应缓冲液,逆转录酶,PS：当模板是RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样进行扩增。,环介导等温扩增反
6、应的操作过程（标准法）,环介导等温扩增法的操作步骤,样本,DNA/RNA提取,等温扩增,检测,约0.5h,1、试剂配制,2、DNA/RNA提取,3、环介导等温扩增反应（扩增）,4、检测,约1.5h,环介导等温扩增反应的检测,琼脂糖凝胶电泳检测,DNA扩增实例,NTC,PS：等温扩增的阳性产物是片段大小不一的梯状条带。,应用浊度检测,环介导等温扩增反应的检测,阳性,阴性,扩增反应会产生一种叫焦磷酸镁的衍生物，此衍生物与生成的扩增产物成正比，由于目的基因大量扩增同时也产生了大量的衍生物，于是出现白色浑浊沉淀（肉眼可见）。,dNTPs,DNA Polymerase,DNA-(dNMP)n+nP2O7
7、,P2O74- +2Mg2+,MgP2O7(白色沉淀),+,荧光目视试剂检测,环介导等温扩增反应的检测,钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光。,+,钙黄绿素Mn2+,dNTPs,Mg2+,DNA聚合酶,扩增反应,钙黄绿素,Mn2+P2O74-,焦磷酸锰（白色沉淀）,应用浊度的实时检测,环介导等温扩增反应的检测,如上图所见，可用分光光度计或浊度计对白色浑浊物（焦磷酸镁）的浊度进行测定。,LAMP与普通PCR的比较,缺点,灵敏度高，一旦开盖容易形成气溶胶污染，故在进行试剂盒的研发过程中可采用实时浊度仪，不要把反应后的反应管打开。,引物设计要求比较高，有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法。,
