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1、疏水性相互作用色谱(HIC),目录,一、概念 二、原理 三、疏水性的吸附剂 四、影响疏水性吸附的因素 五、疏水性相互作用色谱的操作 六、HIC的特点及应用,一、概念 疏水性相互作用色谱(Hydrophobic interaction chromatography，HIC)是利用表面偶联弱疏水性基团(疏水性配基)的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质类生物大分子分离纯化的洗脱层析法。,疏水性相互作用色谱,二、原理,组成蛋白质的氨基酸中包括一些疏水性氨基酸基团，如苯丙氨酸，酪氨酸；这些基团大部分处于蛋白质内部，但有部分疏水基团暴露于蛋白质表面。在高离
2、子强度盐溶液中，蛋白质表面的水化层被破坏，更多的疏水部分暴露在外，这些暴露在外的疏水基团与介质上的弱疏水性配基发生疏水性作用，被固定相(疏水性吸附剂)所吸附。被固定相吸附蛋白质在疏水性吸附剂上的分配系数随流动相盐析盐浓度的提高而增大。HIC采用高盐下吸附，低盐下洗脱。,盐浓过高，沉淀不可,原理图示,Mechanism of HIC,三、疏水性吸附剂,常用配基 苯基、短链烷基、 烷氨基、聚乙二醇聚醚修饰密度 疏水配基修饰密度一般在1040 umol/ml 疏水性吸附作用与配基的疏水性和配基密度成正比，故配基的修饰密度应根据配基的疏水性而异。,四、 影响疏水性吸附的因素,离子强度及种类除离子强度外
3、，离子的种类亦影响蛋白质的疏水性吸附。在高价阴离子的存在下，疏水性吸附作用力较高。HIC分离过程中主要利用硫酸铵、硫酸钠和氯化钠等盐溶液为流动相，在略低于盐析点的盐浓度下进料，然后逐渐降低流动相离子强度进行洗脱分离。,一般配基修饰密度在（1040）mo1cm3之间。配基修饰密度过小则疏水性吸附作用不足，密度过大则洗脱困难。 疏水性配基与亲水性固定相粒子之间的偶联主要利用氨基或醚键结合，形成各种疏水性吸附剂，其中R表示疏水配基。,图中a的末端氨基以及a和b的键合亚氨基显弱碱性，在中性pH范围内带正电荷，因此，这类疏水件吸附剂除疏水性吸附外，还可能存在静电吸附(离子交换)作用。 图中c的吸附剂利用
4、醚键结合不引入荷电基团，对蛋白质仅产生疏水性吸附作用。,疏水性吸附剂,破坏水化作用的物质 蛋白质疏水部位的失水有利于疏水性吸附。因此水化能力低的物质容易作洗脱剂。 SCN，CIO4和I等半径较大、表面电荷密度低，水化能力差，这类阴离子具有减弱水分子之间相互作用。因此，这类阴离子称为离液离子（chaotropic ion）；在离液离子存在下疏水性吸附减弱，蛋白质易于洗脱。盐析作用强的高价阴离子（如SO42，HPO42等）的作用正好相反，称为反离液离子（antichaotropic ion）。除离液离子外，乙二醇和丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作用，降低蛋白质的疏水性吸附作用，经常用做洗脱促
5、进剂 ，洗脱时疏水吸附强烈、仅靠降低盐浓度难于洗脱高疏水性蛋白质。,表面活性剂 表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。根据这一原理，难溶于水的膜蛋白质可添加一定量的表面活性剂使其溶解，利用HIC法进行洗脱分离。 但此时选用表面活性剂的种类和浓度应当适宜：浓度过小则膜蛋白不溶解，过大则抑制蛋白质的吸附。温度 失水是吸热过程，即疏水性吸附为吸热过程，因此与一般物质吸附相比，趋势相反，即温度越高，吸附越容易。,五疏水性相互作用色谱（HIC）的操作,疏水性相互作用色谱在蛋白质的分离过程中由于机理比较复杂，吸附剂的选择和洗脱分离条件不易掌握所以难以取得良好的分离效果。因
6、此，在利用HIC 分离蛋白质的混合物时，需事先利用各种小型预装柱进行吸附与洗脱实验，确定最佳吸附剂和洗脱分离条件分离溶剂。 吸附生物大分子采用柱层析法，装柱和拆柱与其他类型的柱层析法相同。 为了使要分离的生物大分子能紧密结合在柱上，选择适当的缓冲液、pH和离子强度，也要考虑温度因素。,为了有效地洗脱吸附剂上的生物大分子，可以用下列的一种或几种方法：改换一种具有较低盐析效应的离子；降低离子强度；减弱洗脱剂的极性，也可加入乙二醇；用含有表面活性剂的洗脱剂；提高洗脱剂的pH。,每次实验结束后，吸附剂需要再生。 因为吸附剂中尚留有结合紧密的生物大分子、表面活性剂等。未经再生的疏水吸附剂，其吸附容量将明
7、显降低。 一般来说可用蒸馏水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸馏水依次洗涤，装柱，用初始缓冲液平衡吸附剂。吸附剂经再生后可反复使用。,再生,蛋白质的纯化过程中，各种分离技术结合的顺序是很重要的。 疏水层析可用在沉淀步骤之后，或与凝胶过滤、离子交换层析结合使用。,操作1） 加样：样品溶液中补加适量的盐。2） 洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。3） 再生：除去固定相吸附的杂质 ，用水或 8mol/L 脲素溶液 。 应用 主要用于分离纯化大分子物质。,应用 HIC主要用于蛋白质类生物大分子的分离纯化。这种方法与IEC的离子交换作用完全不同。 它不仅是一种有效的分离纯化手段，而且还可与IEC互补短长，分离纯化利用IEC难以分离的蛋白质。 但是，疏水性相互作用机理比较复状。吸附剂的选择和洗脱分离条件不易掌握。,六、疏水性相互作用色谱的应用及特点,特点HIC可作为IEC的补充工具。可直接分离盐析后的蛋白质可通过调节疏水性配基链长和密度调节HIC的吸附力疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当,六、疏水性相互作用色谱的应用及特点,谢 谢！,
