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1、LncRNA wires up Hippo and Hedgehog signaling to reprogramme glucose metabolismLncRNA连接Hippo和Hedgehog信号重新编程葡萄糖代谢,汇报人：兰梦娇学号：18213035,背景介绍,三阴乳腺癌LncRNAHippo signaling Hedgehog signaling,三阴乳腺癌,三阴乳腺癌的癌组织免疫组织化学检查结果为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和原癌基因Her-2均为阴性的乳腺癌，预后与其他类型相比较差，且复发迅速。 肺转移和肝转移的发生率高。,LncRNA,长链非编码RNA(Long
2、non-coding RNA, lncRNA)是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。研究发现, 长链非编码 RNA 的表达或功能异常具体表现在序列和空间结构上的异常、表达水平的异常、与结合蛋白相互作用的异常等它们在癌症中调控染色质结合蛋白，在细胞核中形成核信号复合物，控制蛋白细胞定位，调节基因表达。因此，他们被认为是癌症潜在的治疗靶点,Hippo signaling Hippo通路是一条由一系列蛋白激酶和转录因子组成的激酶链。主要包括三部分: 上游调控元件(NF2、Mer等)、核心组件(主要是Mst1/2、Lats1/2)及下游效应分子(YAP)。在正常机体内, 活化的Mst1/2可以
3、磷酸化并激活其底物 Lats1/2, 活化的Lats1/2可以直接磷酸化下游效应分子YAP, 磷酸化的YAP与细胞质中14-3-3蛋白结合滞留于胞浆中而无法进入细胞核, 从而丧失作为转录辅助因子的功能,Hedgehog signaling在胚胎发育和胚胎形成后细胞的生长和分化过程中都起着重要的作用，控制着细胞的生长与增殖，通路由分泌糖型配体Hedgehog，跨膜蛋白受体PTC和Smo，核转录因子GLI蛋白及下游靶基因组成。Ptc抑制Smo蛋白活性，从而抑制下游通路，这时下游的Gli蛋白在蛋白酶体内被截断，并以羧基端被截断的形式进入细胞核内，抑制下游靶基因的转录。当Ptc和Hh结合以后，解除对S
4、mo的抑制作用，促使 Gli蛋白与PKA及一些未知因子与微管形成大分子复合物，使得全长Gli蛋白进入核内激活下游靶基因转录。,研究发现BCAR4是TNBC中上调的lncrna之一，TNBC转移需要BCAR4通过促进Hedgehog信号通路。我们发现BCAR4是YAP的直接靶点，需要YAP通过GLI2依赖性Hedgehog信号通路促进糖酵解。从机理上讲，BCAR4/GLI2通过上调HK2和PFKFB3两种糖酵解酶来重新编程糖代谢。研究表明，特异性降低葡萄糖氧化会增加肿瘤转移。因为YAP和BCAR4都有利于糖酵解和肿瘤转移。转移是否需要YAP-BCAR4糖酵解，有待进一步阐明。,BCAR4作为YA
5、P下游基因的确定为了阐明可能参与乳腺癌代谢的YAP下游靶基因，我们分析了发表的一篇YAP微阵列数据，这些数据来自于MCF10A稳定过表达载体、野生型YAP、YAP活性突变体(5SA)和YAP非活性突变体(S94A)。首先，在基因转录水平上，YAP- 5SA稳定细胞野生型YAP稳定细胞YAP-S94A和载体控制稳定细胞，建立一组YAP正调控的基因其次，我们通过参考TCGA数据库和相关的出版物，优先选择在癌症中高度表达的基因BCAR4是一种lncRNA，它参与了与乳腺癌转移相关的Hedgehog级联反应，被确定为潜在的YAP下游目标。,一、LncRNA BCAR4是YAP的转录靶点,YAP的过表达
6、显著诱导了BCAR4及其他YAP下游靶基因的转录在此过程中需要YAP的转录活性，因为YAP或YAP活性突变体(YAP- 5SA)过表达显著诱导BCAR4的转录，而非活性突变体(YAP- s94a)则没有,在MDA-MB-231细胞中，YAP的下调抑制了BCAR4和YAP下游基因的转录，通过对BCAR4启动子分析，发现有两个YAP/TEADbinding位点,在葡萄糖刺激下，对照组的BCAR4显著增加。通过荧光酶素检测，发现突变BCAR4启动子中YAP/ TEAD的结合位点，显著降低了YAP/ TEAD诱导的BCAR4的表达,用乳腺癌组织阵列对乳腺肿瘤中YAP与BCAR4水平的相关性进行分析，发
7、现BCAR4的表达与YAP的表达呈正相关,这些数据表明YAP-BCAR4轴可能在乳腺癌的发生发展中发挥致癌作用。,二、YAP诱导糖酵解需要BCAR4,葡萄糖摄取，乳酸生产以及细胞培养基酸化是测量糖酵解的指标在TNBC细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-468中，对BCAR4或GLI2的过表达促进了糖酵解过程。,在YAP活性突变细胞中，敲除BCAR4和GLI2，糖酵解被抑制,在YAP敲除细胞中，分别加入外源BCAR4、GLI2,糖酵解显著提高,因为YAP在促进糖酵解和BCAR4转录方面起作用，BCAR4/GLI2信号可能参与YAP诱导的糖酵解,三、BCAR4/GLI2通过上调糖酵解酶HK2
8、和PFKFB3促进糖酵解,为了识别这些参与糖代谢的BCAR4/ GLI2调控基因，在MDA-MB-231细胞中检测了一组糖代谢相关基因的转录，发现过表达BCAR4/GLI2主要增强了HK2和PFKFB3的表达。,为了验证HK2和PFKFB3在YAP-5SA或BCAR4/ GLI2诱导糖酵解中的作用，用HK2抑制剂与PFKFB3抑制剂对YAP-5SA或BCAR4/GLI2过表达乳腺癌细胞进行治疗，发现抑制HK2和PFKFB3可显著抑制癌细胞对葡萄糖的摄取以及细胞增殖由于HK2和PFKFB3都是糖酵解激活剂，表明HK2和PFKFB3是YAP-BCAR4/GLI2的潜在下游基因，是促进糖酵解作用所必
9、需的,四、HK2和PFKFB3是BCAR4/GLI2的直接下游基因,之前的研究表明BCAR4作为一种LNA，可以激活p300,导致组蛋白标志物H3K27ac等乙酰化，从而激活基因。通过RNA纯化(ChIRP)和染色质免疫沉淀(ChIP)检测，发现BCAR4/GLI2及p300和H3K27ac在葡萄糖刺激下均与HK2和PFKFB3的启动子相关。表明，BCAR4/GLI2/p300复合物通过标记为乙酰化的组蛋白直接激活了HK2和PFKFB3的转录。,五、BCAR4促进YAP参与的肿瘤的发生,在乳腺肿瘤发生10天后，裸鼠每隔一天注射一次杂化LNA或BCAR4 LNABCAR4和GLI2的下调明显抑制
10、了YAP-5SA诱导的细胞增殖，而YAP-5SA的过表达增加了MDA-MB-231移植瘤的生长。与使用LNA治疗相比，在vivo优化的使用LNAs中BCAR4的消耗明显降低了YAP-5SA诱导的肿瘤的生长。,在移植瘤中证实了LNA介导的BCAR4下调BCAR4的缺失降低了YAP-5SA诱导HK2和PFKFB3的上调,在异种移植肿瘤中，BCAR4的缺失降低了YAP-5SA诱导HK2和PFKFB3的表达Ki67和cleaved caspase-3分别提示增殖减少，凋亡增加,六、高YAP/BCAR4表达与乳腺癌患者临床预后不良相关,通过检测乳腺癌组织中BCAR4和YAP的表达情况，发现高水平的BCA
11、R4或YAP不利于乳腺癌患者无复发生存率，而BCAR4和YAP的低水平均有利于无复发生存率,CYR61是一种细胞外基质相关蛋白，处于外信号转导通路下游，可促进细胞增殖，黏附，迁移，分化和细胞外基质合成等作用，在多种肿瘤的发生发展中起重要作用。在乳腺癌患者样本中，BCAR4的表达与YAP或下游基因CYR61的表达呈正相关,这些数据提示YAP-BCAR4轴通过重新编程葡萄糖代谢参与乳腺癌的发生,意义：,癌症的发展在很大程度上依赖于肿瘤抑制素的失活和癌基因的激活，癌基因使细胞不受控制地增殖和存活，最终导致肿瘤的转化。鉴于lncRNA BCAR4在乳腺癌发生过程中调控两个关键的生长相关信号通路Hippo和Hedgehog，进一步研究BCAR4及其相关的致癌功能将使我们能够建立一个公认的乳腺癌治疗靶点。,谢谢观赏,
