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1、研究生：,Tim3/Tim3L信号通路激活在Hp免疫致病及Hp疫苗免疫防治中的作用及其机制,导 师：,研究背景研究内容、研究目标及拟解决的关键问题研究方法、手段、技术路线及可行性分析统计学分析课题创新之处年度计划及预期进展实验条件及经费预算,研究背景,Hp在人群中感染率高，能引起多种严重疾病机体免疫反应在Hp感染致病和Hp疫苗免疫保护中均起重要作用研究Hp感染的免疫致病机制及Hp疫苗防治机制有重大意义,Th免疫反应,Th1与Th2关系,Hp与Th反应,Hp感染,Th1占优势,Th1和Th2失衡,招募Treg,感染持续存在,Hp疫苗,诱导Th1、Th2,Th1和Th2失衡纠正,Treg减少,感染
2、清除,Tim家族,Tim蛋白结构,Tim-3是第一个被发现与T细胞反应有关的Tim家族成员表达在成熟Th1细胞膜上不表达在未成熟Th细胞、Th2细胞上包含Ig-V样结构域的信号肽、粘附素样结构域、跨膜区域、细胞内尾巴Tim-3激活后降低Th1反应Galectin-9是Tim-3的配体，主要表达在CD4+的T细胞Tim-3/Galectin -9通路的激活可导致Th1细胞效应功能的终止,Tim3和Tim3配体,Tim-3与Th1,TLR家族及配体,TLR4信号通路,我们前期研究发现阻断Tim-3信号通路可增加TLR4、MyD88表达、激活NF-BTLR信号的负性调控因子SIGIRR可上调Tim-
3、3的表达提示：Tim-3和TLR4信号通路可相互调控,Tim3和TLR4,我们的前期研究发现，阻断Tim-3信号通路后，Treg减少说明Tim-3信号通路在调节Treg控制炎症反应中起重要作用,Treg和Tim-3,Tim-3/Tim-3L是新发现的调节Th反应的核心环节，并且与TLR4信号通路和Treg密切相关,我们的研究还发现Tim-3阻断提高Hp疫苗的免疫保护率，但并不降低Hp自然感染小鼠胃黏膜内Hp定植密度加剧Hp疫苗接种小鼠和Hp感染小鼠胃黏膜炎症程度提示Tim-3信号通路参与Hp感染的免疫致病和Hp疫苗的免疫保护作用问题：Tim-3信号通路激活，将会对Hp感染和Hp疫苗免疫产生何种
4、影响？目前尚不清楚,体外研究,体内研究,研究内容,研究Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反应、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反应和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系,体内研究,Hp感染和Hp疫苗接种小鼠给予Tim-3L，观察以下指标：小鼠脾细胞中Tim-3阳性细胞数量的变化胃黏膜局部Tim-3表达、 Treg和几个有代表性的Th1（IFN-、LI-12）和Th2（IL-4、IL-10）细胞因子含量的变化胃黏膜局部TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子（TLR4、MyD88、NF-B）的变化。胃黏膜内Hp感染、炎症程度情况,观
5、察指标,淋巴细胞对Hp刺激的增殖反应Tim-3阳性细胞的数量培养上清液中Th1和Th2细胞因子含量CD4+效应T细胞中TLR4信号通路的几个中间环节和下游分子的变化比较它们与未处理组的差异,体外研究,观察小鼠的脾淋巴细胞用Tim-3L(Galectin-9)预处理后与Hp共培养后：,阐明Tim-3信号通路激活对Hp感染和Hp疫苗接种小鼠Th1和Th2免疫反应、TLR4信号通路及Treg的影响，以及这些影响对Hp感染引起的的炎症反应和Hp疫苗免疫保护作用之间的关系,研究目标,阐明Hp感染和疫苗接种后Tim-3/Tim-3L信号通路的变化及与疾病和疫苗保护机制的关系明确通过对Tim-3/Tim-3
6、L信号通路的调控可否减轻Hp相关性疾病的严重程度和提高疫苗的免疫保护作用,拟解决的关键科学问题,研究方法和步骤,体内研究未经处理组: Hp感染组Hp疫苗组 对照组Tim3配体处理组： Hp感染组Hp疫苗组 对照组体外研究未经处理组： Hp刺激组空白组Tim3配体处理组： Hp刺激组空白组,试验分组,Hp标准菌株SS1接种于含7.5%无菌绵羊血的空肠弯曲菌选择性培养琼脂基础上，微需氧条件下（O2 5%、CO2 10%、N2 85%）37培养2-3天 Hp菌液行超声粉碎后，分别与霍乱毒素（CT）和壳聚糖构建以CT和壳聚糖为佐剂的Hp疫苗,HP培养及疫苗制备,6-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，
7、给予含109/ml的SS1 Hp菌液，0.5ml/只灌胃，隔日1次，共5次。末次灌胃4周后，取10只小鼠处死，取胃黏膜进行病理检查和Hp培养，确定Hp感染模型的建立,Hp感染小鼠模型,6-8周龄的SPF级的BALB/C小鼠，每只小鼠给予0.5ml含5ugCT和1.2mg Hp抗原的PBS或0.5ml含壳聚糖微球-1.2mgHp抗原有效量的PBS，于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次，免疫后4周给予109/ml的SS1 Hp菌液，0.5ml/只攻击小鼠，隔日1次，共4次。末次攻击后4周处死小鼠，取标本检测各项指标,Hp疫苗的接种,在小鼠Hp接种和疫苗接种的第1周内，每天腹腔内注射100g Ga
8、lectin-9,Galectin-9预处理,用淋巴细胞分离液分离小鼠脾淋巴细胞，终浓度为500nM/ml的Galectin-9预处理2h ，按细胞与细菌比例：1:100、1:200、1:300浓度，共同孵育24-48（3、6、12、24、48）小时后，测细胞的增殖反应，并收集细胞和培养上清，测各项指标,Hp刺激鼠脾淋巴细胞,采用Western blot法和免疫组化法检测胃黏膜内及培养细胞TLR4、MyD88、NF-B和Tim-3采用Western blot法和免疫组化法检测胃黏膜内Treg采用流式细胞技术检测脾细胞及培养细胞Tim-3阳性细胞 采用ELISA法检测胃黏膜及培养上清内细胞因子含
9、量采用细菌培养和组织学Giemsa染色法检测Hp采用MTT法进行细胞增殖试验,检测方法,技术路线体内研究,技术路线体外研究,课题选题合理，具有理论基础课题所采用的技术均已建立，在技术上确保了本项目的完成 本实验所需的仪器设备本单位基本齐全,可行性分析,计量资料: 多个样本的比较采用方差分析，当方差不齐时采用秩和检验 多个样本的两组间比较采用SNK-q检验计数资料: 采用X2检验等级资料：采用Kruskal-Wallis H检验。 P 0.05时有统计学意义,统计学分析,Tim3/Tim3L信号通路在Hp感染致病及疫苗免疫中作用研究国内外未见报道,创新之处,2011.12-2012.02 查阅相
10、关文献，完成综述2012.03-2012.04 收集资料，完成各项准备工 作，进行预实验2012.05-2012.12 正式实验，并检测各项指标2013.01-2013.03 整理数据并分析，统计处 理，完成论文,年度计划,激活Tim3/Tim3L信号通路可影响Hp感染和Hp疫苗免疫小鼠Th免疫反应、TLR4信号通路及Treg通过调节Tim3/Tim3L信号通路可影响Hp感染结局及Hp疫苗免疫效果发表一篇SCI论文，题目为Tim3/Tim3L信号通路在幽门螺杆菌免疫致病及疫苗免疫中的作用及机制,预期研究结果,BALB/C小鼠 2000元消耗材料费 8000元Western Blot 20000元抗体 70000元RT-PCR 10000元细胞因子检测试剂 15000元流式细胞检测费 20000元总计 135000元,经费预算,谢谢！,
