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1、细胞培养液的配制,培养基的选择 依据: 经验、文献、尝试 常用: RPMI1640、DMEM 培养基的来源 市售干粉培养基-自己配制 液体培养基-直接使用(注意有效期),培养基的除菌方法 过滤除菌: (1) 正压过滤-效率高 (2) 负压过滤-效率低 高压蒸气灭菌: 不含谷氨酰胺，灭菌后另外添加培养基附加成分的添加 按使用说明或实验要求添加 配制时加: 碳酸氢钠、抗生素、血清等 临用前加: 生物活性因子如EGF、FGF、NGF、PDGF等,RPMI1640培养液配制过程,准备物品 (1) 不锈钢过滤器, 滤膜(0.45m,0.22m),磁力搅拌器,天平,烧杯,量筒,盐水瓶 (2) 培养粉,1N
2、 HCl,NaHCO3,青霉素,链霉素,胎牛血清,新鲜三蒸水 消毒物品 滤器中放置0.45m和0.22m滤膜, 包装, 高压蒸气消毒,配制步骤,(1) 10.4g/包培养粉溶至1L三蒸水中, 磁力搅拌20min(2) 加2g NaHCO3/L, 继续搅拌10min(3) 加青霉素100U/mL(80万U溶至4ml三蒸水, 取0.5ml) 链霉素100U/mL(100万U溶至5ml三蒸水, 取0.5ml)(4) 加1N HCl约3mL, 调pH至7.2, 继续搅拌,(5) 按要求加血清（血清一般需经56，30min灭活） 例如: 10%胎牛血清 无血清培养液 900ml 灭活胎牛血清 100ml
3、(6) 正压过滤除菌 (气压适当, 防止滤膜破裂)(7) 分装,贮存于4，2周内用完。(8) 无菌试验: 取样, 37放置2472h, 无细菌、霉菌污染方可使用,注意事项,谷氨酰胺在溶液中很不稳定，分解，放置两周以上时，根据需要添加谷氨酰胺。配制母液（200 mmol/L, 即29.22g/L）, 每100ml加入0.52 ml母液，终浓度14 mmol/L 抗生素在37稳定性维持34d, 可控制轻度污染。防污染重在无菌操作,培养液配制过程 （以RPMI1640为例）,1. 物品准备,(1）滤器、 微孔滤膜、磁力搅拌器、天平、烧杯、量筒、pH计、贮液瓶等。,(2) 培养粉、 NaHCO3、 1
4、N HCl、青霉素、链霉素、血清、新鲜制备的三蒸水,2. 滤器消毒准备,取孔径为0.45m和0.22m滤膜各一张，浸入三蒸水中,将浸湿后的滤膜光面向上依次置于滤器上,将装有滤膜的滤器包装后高压蒸气消毒,3.液体配制, 将培养粉倒入容器中,加入新鲜制备的三蒸水磁力搅拌器充分搅拌,按照实验的具体要求分别加入 NaHCO3和青链霉素（青霉素100U/mL：80万U溶至4ml三蒸水, 取0.5ml； 链霉素100U/mL：100万U溶至5ml三蒸水, 取0.5ml),按要求加入一定比例的血清（血清一般需经56，30min灭活） 例如: 配制含10%胎牛血清的RPMI1640培养液1升，应加入 无血清培养液900ml 灭活胎牛血清100ml,加入1N HCl约3mL,调整pH至7.27.4,磁力搅拌器充分搅拌准备过滤, 无菌条件下装好滤器，检查气体以及液体管道是否通畅。 (一般使用氧气。注意气压适当, 防止滤膜破裂，),将液体倒入无菌滤器，接通气体,过滤后的液体分装于贮液瓶,分装过程严格无菌操作,分装后的液体贮存于4，2周内用完。,谢谢！,
