细胞培养基本技术ppt课件.ppt

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1、研究生实验技能培训讲座 细胞培养基本知识,医学实验中心闾宏伟,主要内容,细胞培养的基本概念细胞培养的基本条件细胞培养用液的配制细胞培养的基本方法培养细胞活力测定细胞冻存和复苏细胞培养的污染和检测,细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生长与增殖的技术。组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小片组织（O.51立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。器官培养 (Organ culture)：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。,一、基本概念,细胞培养,是指从体内取出组织，分

2、离细胞；或使用细胞系，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能特性。,原代培养,概念 取体内新鲜组织，并置于体外条件下生长的细 胞，在传代之前称为原代培养。 优点 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。,大鼠肝细胞原代培养,传代,概念原代培养的细胞或细胞系，在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大，导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养。细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。,HepG2细胞,传代注意事项,接种数量为51048105个

3、/ml。传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。,细胞系（cell line）,原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。有限细胞系（finite cell line） 无限细胞系（infinite cell line）肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞株（ cell strain ）,由具有某些特性与标志的细胞，经选择或克隆化而派生的亚系，这些特性或标志在后续的培养中一直保持下去的细胞群。 再由原细

4、胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。,细胞系或细胞株的命名,以供体患者的姓名命名： HeLa （来源于宫颈癌）以时间地点来命名： CHO 中国仓鼠卵巢细胞 （Chinese Hamster Ovary ） 宫-743： 宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立， 每3天传代，每次接种3105细胞ml以组织来源命名：如BHK(幼地鼠肾细胞) 以临床疾病类型命名：如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞),二、细胞培养的基本条件,无菌条件细胞生长条件细胞检测条件细胞保存

5、条件实验室安全,细胞培养的无菌环境,无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。 （使用前）紫外照射（15-30分钟）每周甲醛熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面一次的方式进行消毒,操作间,超净工作台,工作原理 利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘 埃颗粒，使空气得到净化。 净化空气徐徐通过工作台 面，使工作台内构成无菌 环境。,超净工作台的使用,使用前 开启柜内紫外灯照射1030分钟； 预工作1015分钟，以除去臭氧和使工作台面、空间呈净化状态。使用完毕后 要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。,火焰消毒,在无菌环境进行培养时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如打开或封闭

6、瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。培养瓶滴管、试管、吸管,常用培养器皿的清洗及消毒,玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、和清洗（流水冲洗和蒸溜水冲洗）四个步骤，然后50烘干。 新的橡胶制品洗涤方法 0.5M NaOH煮沸15分钟，流水冲洗，0.5M HCl煮沸15分钟，流水冲洗，自来水煮沸2次，蒸馏水煮沸20分钟，50烤干备用。,清洁液的配制,*,消毒,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，15磅，维持20-30分钟。 消毒前常用的包装材料：牛皮纸、棉布、铝饭盒电热干燥箱：干热消毒，160180，维持2小时。 主要用于玻璃器皿消毒。,细胞培养的实验用品,细胞培养瓶

7、 25平方厘米75平方厘米150平方厘米,细胞培养板6孔12孔24孔48孔96孔,细胞培养皿35mm60mm100mm,冻存管1.2ml 2ml5ml,离心管15ml50ml细胞刮,滤 器,大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。,CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2 。使用CO2培养箱应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松， 以保证通气。保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。,液氮罐,何处购买细胞,ATCC 细胞库(

8、www.atcc.org). 美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心。目前它可以提供以下物品 细胞系3000种 细菌和噬菌体 15000种 动植物病毒 2500种 原生动物 1200种以及重组物品 欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB),国内细胞库,中国科学院细胞库 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心中国典型培养物保藏中心 也称武汉大学保藏中心，是国家知识产权局指定的专利培养物/生物材料菌种保藏机构。http:/,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要2 细胞的生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-

9、7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒,细胞的营养,碳水化合物、氨基酸和脂类三大类也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素,细胞培养的常用液体,水平衡盐溶液 pH调节液消化液抗生素溶液培养基,三、细胞培养用液的配制,水：新鲜的三蒸水或去离子水平衡盐溶液 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液： 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）,平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml D-Hanks液,H调

10、节液,碳酸氢钠液 HEPES缓冲液 是一种氢离子缓冲剂，能在细胞培养过程中较长时间保持恒定的pH范围。 通常使用浓度为1015mM，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。,消化液,胰蛋白酶溶液EDTA溶液 胶原酶溶液,胰蛋白酶溶液,主要作用： 水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。常用浓度：0.25% 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hanks配制，用滤器过滤除菌。消化时间：2-10分钟（显微镜下观察） 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。,EDTA溶液,作用机制： 通过结合（螯合）细胞间质中的二价阳离子

11、，从而破坏细胞间的连接。使用浓度： 0.02%，配制时应加碱助溶。 EDTA不能被血清中和，终止消化后，需用培养液或PBS彻底冲洗培养瓶。,胶原酶溶液,主要作用 水解结缔组织中胶原蛋白成分，而对上皮细胞影响不大。常用剂量： 最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%0.3%，可用 D-hanks、PBS或含血清的培养液配制。分型： 分、型以及肝细胞专用胶原酶，根据 所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型（价格贵）。,胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别,项目 胰蛋白酶 胶原酶 消化特性 消化软组织 消化纤维多的组织 用量 0.01%0.5% 0.10.3 mg/mL（200 U/mL） 消

12、化时间 0.5 2h 1 12h pH 89 6.57.0 作用强度 强烈 缓和 细胞影响 时间过长有影响 无大影响 血清抑活 有 无 Ca2+和Mg2+ 有影响 无影响,抗生素溶液,通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。配制 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万U。 使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。,培养基,分天然培养基和合成培养基天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）,合成培养基,根据

13、细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、另有无血清培养基、无蛋白培养基人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,RPMI1640,最初是由G.E，Moore为培养小鼠白血病细胞而设计的。开始的配方特别适合于悬浮细胞生长，主要针对淋巴细胞，后经过改良，从RPMI1630、RPMI1634、直至RPMI1640。其组分较为简单，适合许多种细胞，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。尤其适合人白细胞，如H9、T-15、

14、HL-60、IM-9和K-562 等细胞系的培养。,RPMI1640种类,RPMI1640（A） （不含谷氨酰胺、可高压灭菌）RPMI1640 （含谷氨酰胺、过滤灭菌）,DMEM细胞培养基,是在MEM培养基的基础上研制的与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（4500g/L）和低糖型(1000g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。 DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高压灭菌】DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌过滤灭菌】DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌过滤灭菌】,血清的使用,血清质量好坏是实验成败的关键常用血清 胎牛血清、新生牛血

15、清、小牛血清、兔血清、 马血清等，胎牛血清是品质最高的。优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。血清的灭活（消除补体活性） 56 ，30 分钟。血清的消毒：过滤除菌,牛血清,胎牛血清应取自剖腹产的胎牛新生牛血清取自出生24小时之内的新生牛小牛血清取自出生1030天的小牛使用浓度： 一般为520，最常用是10。,何谓FBS、FCS、 CS、HS?,FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 是指小牛血清HS

16、 (horse serum) 是指马血清,血清解冻步骤,逐步解冻法 20 或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可分装4045 ml。勿直接由20至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。,无机盐,CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4对调节细胞渗透压、某些酶的活性及溶液的酸碱度都是必须的。,谷氨酰胺,细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4放置1周可分解50，故应单独配制，置于-20保存，临用前

17、加入培养液。配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。谷氨酰胺双肽，如甘氨酰基谷氨酰胺。这种谷氨酰胺在溶液中稳定，并可与谷氨酰胺一样有效地被细胞利用。,完全培养基的组成,基础培养基 8095血清 520碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100Uml,休息一会儿吧！,伸伸退，弯弯腰！,培养细胞的生长方式及类型 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。 悬浮生长型细胞 不

18、需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。,四、细胞培养的基本方法,细胞的贴附过程, 贴附生长型细胞,+ + + + + + +,+ + + + +,贴附物质带正电荷,细胞带负电荷,上皮样细胞,来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核,生长特点 易相连成片 相靠紧密相连成薄层铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动,上皮型细胞,SKOv3（卵巢癌细胞）1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞）2.培养的天数：传代后3d；3.放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清；5

19、.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生 长，生长速度较快。,CCL-1491.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞；2.培养的天数：1d（种在48孔板中）；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透亮贴壁生长，34天传代一次，Giemsa染色。,成纤维细胞样细胞,来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核,生长特点 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而 单独行动 游离的

20、单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起,HUVECs人脐静脉内皮细胞1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞；2.培养的天数：4d；原代培养；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：M199+15胎牛 血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭 形，扁平形或多角形，贴壁生长。,骨髓间充质干细胞1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代；2.培养天数：7天；3.放大倍数：200倍，倒置显微镜；4.培养基种类：DF12+10FBS；5.细胞状态与特征简述：使用percoll密度梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液48h，这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。,每代贴壁细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对

21、数生长期停止期（平台期）,游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为624小时。对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进 行实验研究。停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度依赖性,悬浮生长型细胞,来源：血，脾或骨髓，尤以血中白细胞肿瘤细胞特点：在悬浮中生长良好的细胞，圆形优点：生存空间大，提供数量大， 传代方便，易于收获，可获 得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能 悬浮生长(尤以正常细胞),KU8121.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细

22、胞系；2.培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。,K562细胞1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。,1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉 淀物加新培养液后再混匀传代。 2贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。 常用的消化液是0.25的胰蛋白酶液。,细胞

23、传代方法,首次传代注意事项,细胞生长密度不高时，不能急于传代 原代培养的贴壁细胞需控制消化时间 吹打已消化的细胞应减少机械损伤 首次传代时细胞接种数量要多一些 首次传代培养的pH应偏低些 小牛血清浓度可加大至15%20%左右,细胞计数,计数结果以每毫升细胞数表示细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数,细胞计数步骤,1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数。细胞数/ml4大格细胞总数/ 4104注意：压线细胞

24、只计左侧和上方的。 镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,五、培养细胞活力测定,细胞活力： 总细胞中活细胞所占的百分比。由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,测定方法,台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。流式细胞仪 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。,四唑盐（MTT）比色法MTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有

25、这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值。,六、细胞冻存和复苏,细胞深低温保存的基本原理是： 在80以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键： 在于通过020阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大

26、结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,慢冻程序 4 10 分钟 20 30 分钟 80 16 - 18 小时(或隔夜) 液氮罐长期储存。,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 38水浴中，使其融化（1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,低温保护剂的应用,在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂。冻存液： 含20%血清培养基和10% DMSO（或10甘油） DMSO液用培

27、养液配好，避免因临时配制产热而伤害细 胞。,细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？,冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml 为宜。,七、细胞培养的污染和检测,细胞污染的种类 细菌、真菌、酵母菌、霉菌和病毒污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞,细菌污染,细胞培养常见的污染最常见的有：大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、白色葡萄球菌。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。,真菌污染,真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。,细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。,支原体污染表现,荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体,支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状,白色念珠菌污染,谢谢！,