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1、第十二章 基因工程育种,第一节 概述,广义的基因工程育种概念： 包括所有利用DNA重组技术将外源基因导入到微生物细胞，使后者获得前者的某些优良性状或者利用后者作为表达场所来生产目的产物。真正意义的微生物基因工程育种： 指的是哪些以微生物本身为出发菌株，利用基因工程方法进行改造而获得的工程菌，或是将微生物甲的某种基因导入到微生物乙中，使后者具有前者的某些性状或表达前者的基因产物而获得的新菌种。,基因工程(gene engineering)常和以下名称混用,遗传工程(genetic engineering);基因克隆(gene cloning);分子克隆(molecular cloning);基因
2、操作(gene manipulation);重组DNA技术(recombination DNA technique) 克隆(clone): 作名词时，指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系。作动词时，是指基因的分离与重组过程。,一、基因工程在微生物育种中的应用,（一）通过基因工程方法生产药物 1. 治疗用药物：如干扰素、胰岛素、白细胞介素等； 2. 疫苗：甲肝疫苗、乙肝疫苗等； 3. 单克隆抗体及诊断试剂：前列腺磷酸酶等；（二）通过基因工程方法提高菌种的生产能力（三）通过基因工程方法改进传统发酵工艺（四）通过基因工程方法提高菌种抗性（五）构建超级工程菌应用与环境保护
3、,二、基因工程原理和步骤,基因工程是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下进行“切割”，获得代表某一性状的目的基因，把该目的基因与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的目的基因在受体细胞中进行正常的复制和表达，从而获得目的产物或改变物种特性。,主要步骤包括：,1、目的基因的获得（ DNA片段的取得）2、重组体DNA（ DNA片段和载体的连接）3、外源DNA片段引入受体细胞基因克隆和基因文库4、目的基因的表达和重组体的筛选,切接转检,三、基因工程的研究意义,概括地讲，其意义体现在以下三个方面：1.大规模生产生物分子；2.设计构建新物种；
4、3. 搜集、分离、鉴定生物信息资源。,（一）第四次工业大革命：,1980年11月15日，美国纽约证券交易所开盘的20分钟内，Genentech公司的新上市股要从3.5 $上至89$，胰岛素基因表达 .1. 轻工食品：氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体.2. 能源：石油二次开采、纤维素分解、太阳能转换. 3. 环保：微生物生态种群.4. 信息：蛋白芯片、基因芯片.,（二）第二次农业大革命,1. 生物农药：蛋白类杀虫剂、抗广谱虫害植物；2. 农作物品种改良；高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状；3. 畜牧业；高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率;4. 生物肥
5、料：生物固氮 。,全球商业化转基因作物的概况, 种植面积：全球转基因作物的种植总面积为4420万公顷 地区分布：全球主要的种植大国美国、阿根廷、加拿大、澳大利亚的种植面积占全球总面积的99，其中美国68、阿根廷23、加拿大7、澳大利亚1，余下的1为墨西哥、西班牙、法国和南非等国家 品种分布比例：大豆约占58，玉米约占23，棉花约 占12，油菜籽约占6，其它为1,（三） 第二次医学大革命：,1. 分子病：基因治疗遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症 。2. 抗衰老：端粒酶编码基因，基因疗法，补充突变基因原始产物、更换突变基因,医学方面的应用前景,基因制药,基因治
6、疗,基因诊断,基因克隆,基因芯片,基因工程药物的高回报,碱性成纤维细胞生长因子 231 元/g红细胞生成素 1072 元/g白细胞介素-2 410 元/g巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960 元/g胰岛素 10.2 元/g,四、基因工程的负面影响,现代战争狂人、恐怖主义者利用转基因技术制造难以制服的病原体和生物毒剂。,转基因的超级细菌、病毒一旦从实验室逃逸。,给人类带来难以预测的危害。,第二节 基因工程载体,载体：是携带目的基因并将其转移至受体细胞内复制和表达的运载工具。作为载体DNA分子，应该具备以下一些基本性质：1. 在宿主细胞中具有自主复制和表达的能力；2. 能与外来DNA分子片段结合而又
7、不影响本身的复制能力；3. 载体本身的分子量要尽可能地小，便于多拷贝，便于与较大的目的基因结合。4. 载体上最好有两个以上容易检测的遗传标记；5. 载体上应具有2个以上的限制性内切酶的单一切点。,一、质粒载体（一）质粒载体的选择标记 四环素(tetr)；氨苄青霉素(ampr)；氯霉素(catr)；卡那霉素（kanr）。,（二）质粒载体的发展,质粒构建的发展趋势主要是调整载体的结构，提高载体的效率。（1）将载体的长度减至最小；（2）增加质粒载体内有用的限制酶切点的数目，而且使分布更加合理；（3）在质粒中引入多种用途的辅助序列，使它们可以用于以下目的：,可用组织化学方法鉴定重组体的质粒载体 如pU
8、C质粒，可以编码-半乳糖苷酶氨基端的一个片段。2. 带有单链噬菌体复制起点的质粒载体 如M13噬菌体。3. 带有噬菌体启动子的质粒载体4. 可对重组体进行正选择的质粒载体 如编码tetr的质粒载体。,（三）常用质粒载体,1. pBR322：应用最多。2. pUC18 、pUC193. pUC118 、pUC1194. pSP64、 pSP65、 pGEM-3Z、 pGEM-3Zf(-)、 pGEM- 4、 pGEM- 4Z5. AN136. Bluescript M13+、M13,二、噬菌体载体,噬菌体载体只适合作外源DNA小片段的载体。（一） 噬菌体载体的特点（二） 常用噬菌体载体 1. g
9、t11 2. Charon系列载体三、柯斯质粒载体 专门用来克隆大DNA片段的人工构建的新载体。,第三节 基因工程所用的酶,一、限制性内切核酸酶 能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其附近切割双链DNA的一类内切酶。如EcoR I的切割方式： 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5,二、DNA聚合酶,1. 大肠杆菌DNA聚合酶 2. 大肠杆菌DNA聚合酶大片段（Klenow片段） 3. T4噬菌体DNA聚合酶 4. T7噬菌体DNA聚合酶 5. Taq噬菌体DNA聚合酶及Ampil TaqTM DNA聚合酶 6. 反转录酶 7. 末端转移酶,三、依赖于DNA的RNA聚合酶 1. SP6噬
10、菌体RNA聚合酶 2. T3和T7噬菌体RNA聚合酶四、连接酶、激酶及磷酸酶五、核酸酶 1. BAL31核酸酶 2. S1核酸酶 3. 核糖核酸酶A 4. 核糖核酸酶T1 5. 脱氧核糖核酸酶 6. 外切核酸酶 7. 噬菌体外切核酸酶,第四节 基因工程的主要步骤,一、DNA的制备（一）质粒DNA的制备 1. 细菌培养物的生长 2. 质粒DNA的纯化 3. 细菌染色体DNA的制备,二、目的基因的产生与分离,1. 聚合酶链式反应：PCR法2. 逆转录法：建立cDNA文库3. 从基因所在的生物体直接取得：限制性内切核酸酶 。4. 化学合成法：DNA合成仪。,（一） PCR,类似于DNA的天然复制过程
11、，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：,模板DNA引物4种dNTPTaq DNA聚合酶含Mg2+的缓冲液。,PCR的反应体系,（1）变性：加热至95 ，使模板DNA解开成单链；（2）退火：温度降至适宜，使引物与模板互补结合；（3）延伸：温度升至72 ，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3-OH上，合成与模板互补的DNA新链。,PCR的基本反应步骤及原理,PCR反应的基本原理,（三）逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。,1、mRNA的纯化： 可以用亲和层析法将mRN
12、A从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。 2、互补DNA第一链的合成 mRNA的3末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。,3、互补DNA第二条链的合成 先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。4、互补DNA克隆 根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。,（三）从基因所在的生物体直接取得,鸟枪法,（四）化学合成法,其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或
13、已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,人工化学合成的限制,1、不能合成太长的基因，50-60个碱基对；2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难；3、费用较高。,三、外源基因与载体的连接,1. 粘性末端连接方式：(1) 同一限制酶切位点连接(2) 不同限制酶切位点连接,二、克隆载体的选择和构建,Bam H切割反应,T4 D
14、NA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2. 平端连接适用于：（1）限制性内切酶切割产生的平端 （2）粘端补齐或切平形成的平端,3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,53,35,5 3,35,5 3 A(A)nA,A(A)nA 35,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶+ dATP,末端转移酶+ dTTP,4. 人工接头(
15、linker)连接 由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,CCGAATTCG GGCTTAAGC,5-3-,Eco R,1. 受体菌条件 （1）安全宿主菌 （2）限制酶和重组酶缺陷 （3）处于感受态(competent),四、重组DNA导入受体菌,2. 导入方式,（1） 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（2）高压电穿孔转化大肠杆菌（电转化法）,五、重组体的筛选1. 直接选择法(1) 小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析(2) 插入失活法(3) 互补法(4) 菌落原位杂交法2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,(1) 小规模制
16、备质粒DNA进行限制性酶切分析,(插入失活法)（2）、抗药性标记选择,（3） 互补的检测,X-gal：(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷),原位杂交,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的建立1. 表达载体的构建2. 受体细胞的建立3. 表达产物的分离纯化,六、目的基因的表达,1. 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子 翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足： A. 不宜表达真核基因组DNAB. 不能加工表达的真核蛋白质C. 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 D. 很难表达大量可溶性蛋白,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰
17、表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、费钱,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射,2. 真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,七、基因重组菌的培养,(一）工业使用的基因工程菌应具备的条件1、重组的工程菌最好是分泌型菌株。2、菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。3、菌株必须是不致病的，也不产生内毒素。4、发酵所产生的热量和需氧量都低，发酵温度是适当。5、代谢控制容易进行。6、重组菌形状稳定。,（二）重组DNA实验准则 1974年，有人提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性时问题。后来，美、日等都制定了有关D
18、NA重组实验的准则，这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定采用物理密封(P1P4)和生物学密封(BI和B2)两种方法。,1、物理密封,物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。,2、生物学密封,生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的裁体，通过这样组合的宿主裁体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分BI和B2级，B2级的密封要求最严格。,进行重组菌培养时的设备标准有
19、LS-1和LS-2。LS-2相当严格，工业生产起码应在LS-1的设备标准下培养。LS-l标准要点是：(1) 使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置(2) 培养装置的排气由除菌器排出(3) 使用易产气溶胶的设备时，要安装可收集气溶胶的安全箱等。,第五节 基因定位诱变,基因体外定向诱变的基本方法是先克隆待诱变的目的DNA片段，并将它与载体重组，然后在体外对环状重组体进行定位诱变，再将诱变后的DNA片段导入受体细胞使其表达目标产物。,基因定位诱变的应用,（1）改造酶促反应的Km和Vmax进而改变酶的催化效率。（2）改造蛋白质的最适pH值和温度稳定范围，进而改变酶的作用条件；（3）
20、改变酶的非水溶剂中的反应性，使酶在非水条件下能起催化作用；（4）增强酶的专一性，减少不必要的副反应；（5）增强酶对胞内蛋白酶的抗性，延长半衰期，使酶的产率得到提高；（6）改变酶的别构调节部位，减少反馈抑制，提高产物产率；（7）提高酶的抗氧化能力和改变酶的底物专一性等。,一、定位诱变方法,（一）删除法,（二） 插入法,（三）取代法,特定的G:C变A:T法（1）开创DNA单链区 先形成单链，再利用DNA聚合酶的降解作用。（2）G:C变A:T 单链DNA胞嘧啶被酸式亚硫酸离子作用后反应脱氮基变成尿嘧啶，单链区修补成双链时，A将于U配对，此时的U相应于T。,2. 错配取代,（四）低聚核苷酸诱导法,二、将变异基因送回染色体,1. 体内自发的同源重组 将诱变后的DNA分子重新导入细胞后，DNA 片段会与染色体的同源序列自发重组。缺点是重组的频率低。2. 定位整合作用,思考题,1. 微生物基因工程育种、cDNA文库2. 基因克隆载体的基本性质有哪些？3. 简述基因工程的主要步骤。,
