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1、实时荧光定量PCR原理及应用,谢建红,实时荧光定量PCR的基本原理,实时荧光定量 PCR 就是 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。,在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 .,荧光扩增曲线 分为三个阶段：荧光背景信号阶段 、荧光信号指数扩增阶段和平台期。,荧光背景信号阶段 ：为扩增最初的1015个循环，扩增的荧光信号被荧光背景信
2、号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。,指数期：此期PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。,荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数
3、被称为 CT 值 。,CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， 到达荧光阈值的CT 值越小，反之越大。,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表 Ct 值。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,定量方法,绝对定量：是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量。,相对定量：是通过与内参基因Ct值之间的相差来计算表达基因的差异，也称之为2 -Ct。,其他定量方法,荧光定量
4、PCR检测模式,荧光定量PCR的理论基础：均基于荧光共振能量转移（FRET)的原理，即当一个荧光基团与一个淬灭基团的距离邻近时（10nm)，就会发生荧光能量转移，淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分开，淬灭作用即消失。,检测模式,SYBR Green I 检测模式 ：SYBR Green I 是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合染料。与双链 DNA 结合后，其荧光大大增强。,在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发
5、射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。 SYBR Green I 工作原理,缺点：PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，引起假阳性。优点：通用性好，价格低，在科研中使用较普遍。,水解探针模式（Taqman）,TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的 5 末端，而淬灭剂则在 3 末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3 端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5 外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。,一分子的产物生成就伴随着一分子荧光信号的产生，随着循环数增
6、加，荧光信号不断积累。,分子信标探针模式,分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针 。分子信标的茎环结构中，环一般为 15-30 个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般 5-7 个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。,模板不存在时形成茎环结构，荧光基团和淬灭基团紧紧靠近而被淬灭。当存在模板时，环序列将与模板配对，此时分子信标成链状而非茎环状，荧光基团与淬灭剂分开，使得荧光基团发出荧光。,其它还有双杂交探针、蝎形探针、LUX Primers 等模式。,引物设计原则,引物最适长度为1520bp.G+C含量为4060%。引物的
7、Tm值应相似，差异不超过12.产物长度在80150bp.不能形成引物二聚体。,Taqman探针设计原则,长度30-45bp,Tm比引物至少高5。尽量靠近上游引物。5端不要有G，G会有淬灭作用，影响定量。3端必须封闭。,实时荧光定量PCR的应用,目前 实时荧光 PCR 技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面： 1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 ：包括 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi基因失活率的检测等。,2. 基因表达差异分析:例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证. 3. 基因分型:例如 SNP 检测，甲基化检测等。,谢谢！,
