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1、第二章第二节蛋白质结构解析,蛋白质的氨基酸序列分析生物质谱X-射线晶体衍射技术核磁共振技术,主要内容,一、蛋白质和多肽的氨基酸序列分析,Synopsis: 1. A practical approach to determining amino acid sequence requires a method to remove one amino acid at a time from a polypeptide chain. 2. This is achieved by the use of phenylisothiocyanate（异硫氰酸苯酯）as the N-terminal labe
2、ling reagent, the Edman method(亦称PTC法或PTH法 ). 3. This technique can only deal with chains of 20 to 60 amino acids, and most proteins are much larger. 4. To complete the process, selective hydrolysis of the polypeptide chain cuts very long polypeptides into specific fragments of more manageable size.
3、,1.N端序列分析Sanger was the first person to determine a protein sequence, for insulin in 1953. The problem: after labelling the N-terminal amino acid, the polypeptide chain must be hydrolysed to isolate and identify the labeled amino acid. Whats needed is a way to remove the first amino acid without hav
4、ing to hydrolyze the whole chain.This was solved by Per Edman, in Sweden in 1956,by using the reagent phenylisothiocyanate to label the N-terminal end of the polypeptide sample.,It works by cleaving the N-terminal AA off and leaving the rest of the peptide intact.The Edman method can be repeated on
5、the peptide remaining after the reaction, so this is a very effective method for obtaining AA sequence information.In fact the whole sequence of a peptide containing many AAs can be determined by Edman method.,降解反应分三步偶联 PITC的异硫氰酸酯基与蛋白的自由氨基作用，产生苯氨基硫甲酰蛋白质。裂解 PTC蛋白质在无水条件下酸裂解，切下反应的那个残基，暴露出下一个自由氨基。转化 ATZ
6、氨基酸不稳定，在三氟乙酸水溶液条件下，转化成稳定的PTH氨基酸。PTH氨基酸的鉴定 薄层层析，HPLC, GC(气相色谱），质谱分析等。,PTH氨基酸,ATZ氨基酸,2. C端序列分析适用 1. 鉴定重组蛋白是否正确表达2. 大规模生产时质量控制3. N端封闭蛋白的分析4. DNA探针的设计原理化学试剂与蛋白质和多肽的羧基反应，反应后的C末端衍生物被切割下来，通过HPLC系统进行分析。,质谱：Mass Spectrometry (MS) 指带电原子，分子或分子碎片按质荷比(m/z)的大小顺序排列的图谱。,二、生物质谱技术,质谱（MS）技术的基本原理,样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）
7、的差异来分离并确定样品的分子量。,软电离技术： 离子化过程中不会破坏分子结构 电喷雾电离（ESI ) 基质辅助激光解析电离（MALDI) 质谱仪组成： 离子源，质量分析器，检测器,MALDI MS 电离基本原理： 将分析物分散在基质分子中并形成晶体。激光照射晶体时，使基质晶体升华，基质和分析物膨胀并进入气相。The MALDI instrument is a matrix assisted laser desorption ionisation - time-of-flight （TOF) mass spectrometer，specifically for high throughput m
8、ass mapping of peptide digest fragments originating from proteins excised from 2D-gels i.e. proteomics.,matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry( MALDI-TOF MS ),linear mode and reflection mode,MALDI离子源 电离技术的关键-基质的使用 基质的作用：样品离子形成过程中充当 质子化或去质子化试剂，使样品分子带 上正电荷或负电荷。常用基
9、质： SA(芥子酸） DHB(龙胆酸） CCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸）,ESI -MS电离方法：靠强的电场使分子电离。分析物溶液流经一个毛细进样针，针头上加高电压用来产生正离子。高电压导致样品液流分散为呈喷雾状的带电荷的微小滴。当液滴从针尖通往入口时，在定向惰性气体流作用下，溶剂蒸发，液滴缩小，电荷密度增加，最终液滴爆裂，离子从液相中释放出来进入气相。ESI -MS 优势：可与多种分离技术联合使用，如LC -MS, HPLC -MS 等。,It is operated with electrospray ionisation and samples can be introduced in
10、to the mass spectrometer by a number of different techniques.,分子量测定肽谱测定多肽和蛋白质序列测定巯基和二硫键定位蛋白质翻译后修饰蛋白质复合体分析蛋白质组研究,应用,三、X射线晶体衍射技术,X ray diffraction method 使用X射线作为物理工具，间接地研究蛋白质晶体的空间结构。X ray diffraction techniques give information about the structure of solids, that is, the arrangement of the atoms that
11、compose the solid.,X射线晶体衍射的基本原理,原理: X射线入射到样品晶体分子上时，分子中的每个原子使X射线发生散射，这些散射波之间相互叠加形成衍射图形。分析衍射图形可以得到样品内部的结构信息,利用X射线晶体衍射法测定蛋白质分子的构象，结果比较可靠。但是，与溶液中的构象相比，蛋白质分子在晶体中的构象是静态的。所以，利用蛋白质晶体不能测定不稳定的过渡态的构象。而且，很多蛋白质很难结晶，或者很难得到用于结构分析的足够大的单晶。另外，X射线晶体衍射的工作流程较长。,不足之处,蛋白质X射线晶体结构测定的基本过程：经基因克隆，表达后生成的蛋白质提纯；晶体生长并经冷冻处理；重原子衍生物制
12、备；衍射数据收集；衍射数据分析和改进；获得最后的结构模型（包括修正）。,1. 对原材料的要求 应具有高度均一性 2. 晶体生长的生化，物理条件 pH值，离子强度，温度等 3. 技术和方法 分批静置法(batch method) 悬滴法(hanging drop) 4. 蛋白质晶体的鉴定,蛋白质结晶和晶体生长Crystallization,四、核磁共振波谱技术,Nuclear magnetic resonance (NMR)核磁共振是研究处在静磁场中的原子核与电磁波相互作用的学科。NMR技术是目前唯一能够用以测定蛋白质溶液三维结构的方法。,NMR测定蛋白质三维结构的基本过程,原理: 核磁共振是指
13、核磁矩不为零的核，在外磁场的作用下，核自旋能级发生塞曼分裂(Zeeman splitting)，共振吸收某一特定频率的射频（radio frequency, RF）辐射的物理过程。近年来，NMR法测定小蛋白的三维结构得到了成功的应用。NMR法不需要制备蛋白质晶体，但这种方法仅限于分析长度不超过150个氨基酸残基的小蛋白。,应用方面：2D和3DNMR方法已提供相当数量的小蛋白质，寡核苷酸，寡糖的三维结构。提供有关局部结构，构象动力学的信息。用来表征电荷状态、构象、与配体结合的解离速度、研究蛋白质卷曲与折叠。鉴定蛋白质分子中某些原子与配体分子中某些原子的相互接触，研究大分子之间以及它们与小分子之间相互作用和分子识别。,第五节 溶液中蛋白质分子构象的研究方法,一.紫外吸收法,二.荧光光谱法,三.圆二色性,小节,质谱分析是蛋白鉴定的有力工具X射线晶体衍射技术是最主要、最准确的蛋白空间结构测定方法。NMR是新发展起来的技术，在蛋白三位空间结构测定、蛋白质反应动力学、蛋白质与配体的作用方面有重要的作用。但是，对于柔性的、结构复杂的、难以结晶的大分子蛋白质无能为力；NMR对质量较大的蛋白质也没有办法。,
