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1、RNA,药学1201班1组,基本内容,1、人类细胞质RNA的提取2、RT-PCR技术3、RNA的琼脂糖凝胶电泳,基本内容,1、人类细胞质RNA的提取2、RT-PCR技术3、RNA的琼脂糖凝胶电泳,RNA,RNA概论,常见提取方法,技术应用,DNA，RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。DNA是遗传信息的主要载体，蛋白质是生命的物质基础，在DNA和蛋白质之间,RNA起着中介作用。与DNA相比,RNA种类较多,分子量相对较小,在遗传信息表达和调控过程中各类RNA分别发挥作用。这是我们对RNA的基本知识。下面图示为中心法则：,1、人类细胞质RNA的提取,RNA概论,信使RNA(
2、mRNA),携带从DNA转录来的遗传信息,转运RNA(tRNA),负责蛋白质合成时氨基酸的转运,核糖体RNA(rRNA),在核糖体中起装配和催化作用,具有催化作用的RNA,即核酶RNA和其它RNA的自我催化分子,基因组RNA,指一些病毒以RNA为遗传物质,指导RNA,mRNA样非编码RNA,其转录和加工方式同mRNA,但不翻译为蛋白质,tmRNA,本身既是mRNA又是tRNA,翻译时一身二任，如大肠杆菌中的10SaRNA,小胞质RNA,存在于细胞质中的小RNA分子，如信号识别颗粒,小核RNA,是剪接体的组分,是指导RNA编辑的小RNA分子,核仁小RNA,参与rRNA的加工,端粒酶RNA,是真核
3、生物端粒的模板,反义RNA,可通过与靶位序列互补而与之结合的RNA,或直接阻止靶位序列功能，或改变靶部位构象而影响其功能。,1、人类细胞质RNA的提取,常见提取方法,异硫氰酸胍一步法提取RNA异硫氰酸胍氯化铯超速离心法盐酸胍有机溶剂法氯化锂尿素法,1）异硫氰酸胍一步法提取RNA,主要原理,异硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚/氯仿抽提，使RNA与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。,1）异硫氰酸胍一步法提取RNA,操作流程,1.100mg组织加1ml变性液冰浴匀浆。2.将匀浆液移人5mlEppen
4、dorf管内，加0.1ml2mol/L乙酸钠pH4.0，颠倒混匀，加1ml水饱和酚，彻底混匀，加0.2ml49:1氯仿异戊醇，彻底混匀，04培育15min。3.于4以10000rmin离心20min，移上清水相到另一管。4. 加 lml 100异戊醇沉淀 RNA 20 30min，于 4以 10 000rmin离心10min，弃上清液。5. 溶解RNA沉淀在0.3ml变性液中，移入1.5ml离心管中。6. 用 0.3ml 100异丙醇沉淀 RNA 2030min，10000rmin离心10min弃上清液。7.悬RNA在75乙醇中，振荡，室温孵育1015min。8.10000rmin弃上清液，真
5、空干燥510min。9.用DEPC水100200ul溶解RNA样品，可存于70或在乙醇中置20保存。,1）异硫氰酸胍一步法提取RNA,注意事项,1.操作时必须戴手套。2.所用的器皿和试剂均须经DEPC水处理或250300干烤4h。3.DEPC致癌。,2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心法,主要原理,异硫氰酸胍抑制RNA酶的活性，以CSCl为介质，进行密度梯度离心，分离RNA时，因RNA在CSCl 溶液中的密度比蛋白质和DNA大，经离心后，RNA沉降到管底而DNA与蛋白质溶于上清液中，达到分离RNA的目的。,2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心法,操作流程,1 .加57倍于组织细胞体积的异硫氰酸肌匀浆液至含样品
6、的勾浆器中。高速匀浆 l2min。2. 加十二烷基肌酸钠（SLS）至终浓度0.5，混匀，5000rmin室温离心10min。3 .在Beckman离心机相应离心管中，20按下表超速离心。,4.弃23GIT溶液，用吸管将下13吸出，用于染色体DNA的制备，管底胶状沉淀即总RNA。5.用70乙醇洗RNA沉淀，弃乙醇，干燥。6.用300ulTEpH7.6（含0.1SDS）溶解RNA沉淀，用等容积酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。7 .上清加人0.1体积3mol/L NaAc（PH 5.2），2倍体积乙醇混匀，7030min。8. 于4以12 000rmin离心 10min，弃上清液，70乙醇漂洗 RNA
7、沉淀，12 000r/min离心5min，弃上清液，真空抽干燥。9. DEPC水适量溶解RNA，测定OD260与OD280，计算RNA的质量与浓度，20或加3倍体积的乙醇70保存。,2）异硫氰酸胍氯化铯超速离心法,注意事项,1.本方法适用于一组织或108个细胞的RNA的提取，不适用于小分子(5SRNA，tRNA）的提取。2.操作过程中避免RNase的污染。3.离心温度低于4或离心速度太快将导致CSCI析出。,3）盐酸胍有机溶剂法,主要原理,利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质。,3）盐酸胍有机溶剂法,操作流程,1.组织样品中加10倍体积盐酸胍匀浆液，高速匀浆1min。2
8、.室温5000rmin离心10min。3.取上清，加0.1倍体积3mol/LNaAc（PH5.2），混匀，加 2.5体积预冷的乙醇充分混匀，0放置2h。4.于0以5000rmin离心10min，弃上清液，室温干燥。5,加人10ml15ml盐酸胍匀浆，搅拌溶解。6. 加人2.5体积冰预冷的乙醇，立即充分混匀，20放置2h。7 . 45000rmin离心10min，弃上清液，室温挥发乙醇。8 .重复6、7两次（即总共用0.5倍体积乙醇沉淀3次）。,9.按5ml/组织g加0.02mol/LEDTA（pH8.0）溶解核酸。振荡12min，3000rmin，离心2min取上清液。10.等体积氯仿正丁醇（
9、4:1）抽提，5000r/min室温离心10min，取上清液。11.加3倍体积4mol/LNaAc（PH7.0）混匀，20放置1h。12.于0以5000rmin离心20min，弃上清液。用4预冷的3molLNaAc（PH7.0）漂洗RNA沉淀，205000rmin离心20min，弃上清液。13.按1ml/组织细胞(g)加0.2SDS，0.05mol/LEDTA（PH8.0），溶解RNA。14. 加2倍体积预冷乙醇混匀，0放置2h。于 4以 5000rmin离心10 min。弃上清液70。乙醇漂洗RNA沉淀，离心1min，奔上清液，室温干燥蒸发乙醇。15 .用适量双蒸水溶解 RNA沉淀，加3倍体
10、积乙醇，70保存备用。,3）盐酸胍有机溶剂法,注意事项,1 .避免DNA污染。2 .可用无Rnase的Dnase处理污染的DNA。,4）氯化锂尿素法,主要原理,利用高浓度尿素变性蛋白质，抑制RNA酶，选择性沉淀RNA。,4）氯化锂尿素法,操作流程,1 .将0.51.0g寡聚（dT）纤维素悬浮于0.1mol/L 的 NaOH 溶液中。2 .用1ml注射器或吸管（经DEPC水处理并高压），将寡聚（dT）纤维素装柱0.51m，用3倍柱床体积的消毒水洗柱。用1上样缓冲液洗柱，至洗出液 pH8.0。3. 将 RNA溶于消毒水中，65加热 5min冷却至室温，加等容积 2上样缓冲液，混匀上柱立即收集流出液
11、，当RNA上样液全部进人柱床后，再用1柱床容积的1上样缓冲液洗柱，收集流出液。将所有收集液65加热5min，冷却室温，上柱，收集流出液。4 .用510倍柱床体积的1上样缓冲液洗柱，按1ml分部收集，OD260测RNA含量。5. 用23柱体积的洗脱缓冲液洗脱Poly（A+）RNA，分部1312柱容积收集，OD260分别测 Poly（A）RNA值，合并Poly（A）RNA。,6 .加 1/10体积的3mol/L NaAc pH 5.0混匀，再加 2.5体积的预冷冰无水乙醇，混匀。20沉淀 RNA 30 min。7 。于4以 10 000g离心15min，弃上清液。70乙醇漂洗沉淀，10 000rm
12、in室温离心5min，弃上清液，室温蒸发乙醇。8 。适量DEPC水溶解RNA，3倍体积的乙醇，混匀，70保存。,4）氯化锂尿素法,注意事项,1 .在无RNase环境下操作。2 .比色杯用浓盐酸或甲醇（1:1）溶解浸泡1h，DEPC水反复冲洗。3. 十二烷基肌酸钠盐在18以下溶解度下降会阻碍柱内液体流动。4 . 1OD260相当于40ugml RNA，107细胞能提取 1-5ug poly（A+) RNA，相当于上柱RNA量的12。,小结,以上四种方法都能将RNA从细胞质中提取出来，但是通过紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳检测发现，盐酸胍有机溶剂法未能完全除掉DNA，异硫氰酸胍氯化铯超速离心法
13、可活的高纯度的RNA，但是所需仪器和试剂昂贵，费时费钱，一步法提取的RNA纯度高且未被降解，简便快速，既可用于大量样本，又可用于微量组织，细胞的RNA提取。,RNA的纯化方法,在使用RNA提取试剂进行RNA提取时，常使用氯仿进行抽提，以去除蔗糖、蛋白等杂质，并促进水相与有机相的分离，从而。达到纯化RNA的目的,有机溶剂抽提法氯仿抽提,硅基质吸附法,通过专一结合RNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，使样品在高盐条件下与硅胶膜特异结合，而蛋白、有机溶剂等杂质不能结合到膜上而被洗脱，盐类则被含有乙醇的漂洗液洗涤，最后用RNase-freeddH2O将RNA从硅胶膜上洗脱下来,RNA提取的应用,完整R
14、NA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。,2、RT-PCR技术,简介,RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。逆转录PCR，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。,2、RT-PCR技术,原理,提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为
15、模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。,2、RT-PCR技术,操作流程,1.从细胞或特定组织中提取总RNA；2.逆转录实验；3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。,2、RT-PCR技术,注意事项,1、作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。2、用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。,3、由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶
16、）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 4、RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。,2、RT-PCR技术,主要方法,实时荧光定量RT-PCR技术,在PCR反应 体系中加入荧光基团，利用荧光信号积
17、累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模版进行定量分析的方法。,实时荧光定量RT-PCR技术,操作流程,1.从细胞或特定组织中提取总RNA；2.逆转录实验；3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。,2、RT-PCR技术,荧光标记探针,水解探针模式,该探针能被DNA合成酶( 例如Taq 酶) 的5 一3 活性所降解, 探针的5 端有一荧光报告基团, 3 端有一荧光淬灭基团, 当2 个基团相互先靠近的时候, 由于发生能量传递作用, 报告基团不能发出荧光, 但随着扩增反应的进行, 5 端的报告基团随着探针的水解而脱落下来,不再发生能量传递作用, 从而能发出荧光, 被信号探测器所捕获。常同
18、探针5 端相结合的基团有FA M(6-羧基荧光素),TET(四氯-6-羧基荧光素) , JOE(2,7-二甲基-4 , 5-二氯-6-羧基荧光素) , HEX ( 六氯-6-甲基荧光素)或VIC , 常与3 端相结合的荧光淬灭基团常为TAMRA ( 6 -羧基四甲基若丹明) 或DABCYL4 -(4 -恶烷氨基苯偶氮) 苯甲酸。,分子信标探针,它是一种单链DNA 形成的发夹结构, 在其一端有一报告基团,在另一端有一淬灭基团5,当它形成发夹结构时, 由于荧光报告基团与淬灭基团相互靠近,两者之间发生荧光信号能量共振转移(FRET),当热循环温度达到分子beacon 的解链温度时, 其构象发生改变,
19、 能与模板结合而完全伸展成线性分子, 使得FR ET 消失, 报告基团发出荧光信号。分子信标特别适用于检测点突变, 这能区分只有一个核昔酸差异的不同DNA序列, 而且其敏感性要远比同等长度的寡核昔酸探针高。,2、RT-PCR技术,定量分析RNA-CRS的选择和构建,选用在组织中普遍表达且表达量比较恒定的一类mRNA管家基因的作用有:1、用于核昔酸的拷贝数的比较; 2、作为内源性对照补偿待RNA提取效率、逆转录及扩增效率的差异, 以及反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素; 3、管家基因在各组织中恒定表达,而且不受试验处理影响,所以可以以管家基因的定量来作为某种标准来比较样本来源不同的目的基
20、因表达量的差异。通常选用的管家基因有甘油醛-3-磷酸-脱氢酶( GAPDH ) mRNA 、-actin m RNA 、2-微球蛋白mRNA 和rRNA , 研究者也可以根据具体的需要选定合适的管家基因, 根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量, 再将目的基因同管家基因的比值作为定量的最后结果。,2、RT-PCR技术,优点,1、操作简便、快速高效,具有很高的敏感性性;2、由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定,大大降低了污染的可能性; 3、再次,由于在PCR扩增过程中能实时监控PCR扩增情况,可以及时调整反应参数; 4、由于传统的RT-PCR方法对基因的定量是在PCR 扩增和电泳之后,
21、扫描条带, 根据颜色的深浅来定量,误差较大,而实时定量RT- PCR技术不需电泳而直接用软件分析,一方面避免了接触EB,另一方面可以使定量快速而简便, 实现高通量检测。,2、RT-PCR技术,缺点,1、在操作过程中会不可避免地扩增基因组DNA；2、由于样品处理、仪器的差异和个人操作会造成实验的误差，导致定量测量的偏差。3、定量RT-PCR只能定量mRNA水平,但mRNA水平可能不能反映细胞中产生的蛋白水平, 因为在转录后还有许多调节因素。所以要准确而全面的了解机体的表达水平, 除了分析mRNA的水平外,还需要免疫组织化学和生物化学实验的数据。,3、琼脂糖凝胶电泳分析,结果,应用,分析原理,琼脂
22、糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。,RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%-1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。,3、琼脂糖凝胶电泳分析,常规的水平式琼脂
23、糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。,说明,3、琼脂糖凝胶电泳分析,（1） 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。（2） 配制琼脂糖凝胶。称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。待胶凉至60-70 ，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MO
24、PS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。灌制琼脂糖凝胶。,RNA的变性琼脂糖凝胶检测,（3） 样品准备： 取 DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂： 10 x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品 4.5ul,混匀。 将离心管置于60水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。 向管中加入3ul 上样染料，混匀。（4）上样。（5）电泳：电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。（6）电泳结束后，在紫外灯下检查结果。,结果分析,RNA样品电泳后，若可见28S、18S及5S小分子RNA条带，则说明完整性好。若有降解可能是操作不
25、当或污染了RNase.。28S和18S RNA比值约为2：1,表明RNA无降解。若比值逆转，则表明RNA降解。电泳中如果在28S 后方还有条带，表明有DNA污染，应用DNase处理后再进行纯化。5S基本很模糊可有可无。,较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰，如果条带模糊暗淡，单从琼脂糖凝胶电泳角度来说，可能的原因：溴化乙锭见光易分解，母液配制时间过长或保存不当(一般4 避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到05 vgml；电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用23次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。,实际工作中经常发现DNA 分子量标准小片段模糊不清，是因为琼脂糖凝胶浓度一般不超过2 0 ，较小的核酸片段在它的分辨范围之内，并且EB带正电荷，电泳时会向负极移动，如果将凝胶置含EB(05#gm1)的水溶液中30 min，较小的片段则可重新染色：另外，溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂，操作过程中要戴手套，并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存,应用,DNA的制备。适合分离和提取大片段DNA。PCR产物在琼脂糖凝胶上进行的电泳检测。琼脂糖在其他方面的应用 琼脂糖在免疫扩散法中的应用。 琼脂糖在双链DNA探针的合成方法中的作用。双链DNA探针的合成方法主要有切口平移法和随机引物合成法。,谢谢观赏,药学1201班1组,
