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1、,转化子的筛选与重组子的鉴定,为什么要进行转化子的筛选和重组子的鉴定？,在DNA体外重组实验中，外源DNA片段与载体DNA的连接反应物一般不经分离直接用于转化，再加上重组率和转化率的不理想，因此必须通过筛选和鉴定来区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、期望重组子与非期望重组子。转化子：接纳载体或重组分子的转化细胞。非转化子：为接纳载体或重组分子的非转化细胞。重组子：含有重组DNA分子的转化子。非重组子：仅含有空载载体分子的转化子。期望重组子：含有目的基因的重组子。非期望重组子：不含目的基因的重组子。,转化子,重组子,期望重组子,三者的关系,转化子的筛选与重组子的鉴定方法,基于载体遗传标记的筛
2、选与鉴定 利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组子基于克隆片段序列的筛选与鉴定 由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期望重组子。在大多数情况下，待克隆的目的基因或DNA片段的序列至少部分是已知的，因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有广泛的实用性基于外源基因表达产物的筛选与鉴定 如果克隆在受体细胞中的外源基因编码产物是蛋白质，则可通过检测这种蛋白质的生物功能或结构来筛选和鉴定期望重组子,基于载体遗传标记的筛选与鉴定,抗药性筛选法,营养缺陷性筛选法,显色模板筛选法,噬菌斑筛选法,可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子。,非重组子：Apr、Tcr,
3、重组子：Aps、Tcs,抗药性筛选法,将外源DNA片段插入BamH I、Sal I位点,基本操作：,营养缺陷性筛选法,基本原理：,营养缺陷型筛选法可以区分转化子与非转化子，一般不能区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子 。,Lys,Lys+,Lys,Lys+,基本原理图示：,常见的营养缺陷型筛选标记：,哺乳动物细胞中存在两条dTTP的合成途径：,用于大肠杆菌的营养标记基因常选用色氨酸生物合成基因trp+,用于高等哺乳动物细胞的营养标记基因常使用胸腺嘧啶核苷激酶基因tk，
4、相应的受体细胞则选择tk-缺陷型,dCDP,dTDP,dTTP,TR,dTMP,dTDP,dTTP,AP,TK,AP 氨基喋呤,TK 胸腺嘧啶核苷激酶,显色模型筛选法,基本原理：,显色筛选法可以区分转化子与非转化子，也可区分重组子与非重组子。其原理是：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。,显色筛选法的基本操作：,pUC18,Ap,r,lacZ,ori,Ap + X-gal,重组子（Apr + lacZ-）,将外源基因克隆在pUC18的la
5、cZ标记基因内部，使之灭活，此时重组子呈Apr、lacZ-，淡黄色菌落；而非重组子则呈Apr、lacZ+，蓝色菌落,噬菌斑筛选法,重组子,非重组子,1.取代型载体 噬菌斑中的噬菌体即为重组子。2.插入型载体 根据载体上的标记基因筛选。（如：lacZ）,基于克隆片段序列的筛选与鉴定,PCR鉴定法,菌落原位杂交法,限制性酶切图谱法,亚克隆法,DNA序列测定法,PCR鉴定法,PCR技术的两大主要用途为目的基因的获得和DNA特定序列的检测。根据引物互补区域的不同，PCR技术即可用于区分重组子与非重组子，也能鉴定期望重组子与非期望重组子，甚至还能探测目的基因或DNA片段是否整合在受体细胞的基因组上。上述
6、PCR鉴定程序一般需要将筛选平板上的单菌落分别挑出进一步培养，因此不太适用于成千上万个转化子的鉴定。,转化子 重组子,非期望重组子,转化子 期望重组子,期望重组子,受体基因组,非整合子 整合子,工作原理：,菌落原位杂交法,菌落原位杂交法（又称探针原位杂交法）能从成千上万个转化子中迅速检测出期望重组子，其前提条件是必须拥有与目的基因某一区域同源的探针序列。根据核酸杂交原理，探针序列特异性的杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位检测。,原位杂交的操作程序,探针的制备,探针的长度以及与目的基因之间的序列同源性是杂交实验成败的关键最佳的探针长度范围为1001000bp探针内部不能含有大面积
7、的互补序列，会直接影响探针与DNA靶序列的杂交。探针的获取方法：1、目的基因的同源序列2、cDNA3、人工合成,探针的标记,探针在杂交后是通过其分子中的放射性同位素或荧光基团进行定位示踪的，放射性的强弱直接关系到杂交反应的灵敏度。单位长度探针标记的同位素越多，杂交反应灵敏度就越高。探针标记方法：1、5端标记法。2、反转录标记法。3、缺刻前移标记。4、ABC标记法。,5端标记法,P,P,DTT、Mg2+、-32PdATP、过量ADP,T4-PNP酶,P,P,方法1,P,P,碱性磷酸酶,P,P,方法2,T4-PNP酶,变性制备单链探针,缺刻前移标记法,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,DNa
8、se I,DNA聚合酶I,dNTP、-32PdATP,变性,限制性酶切图谱法,所谓的限制性酶切图谱法就是对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分析，并以此与目的基因的已知图谱对比，因此利用这种方法不仅能区分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。但这种方法在用于数千规模的转化子筛选时，工作量极大，实验成本也高。,全酶解图谱法,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,电泳观察酶解产物片段,重组子： 2.7 kb + 4.0 kb,非重组子： 2.7 kb,如果外源DNA片段也是2.7 kb，最好选用单一切口的酶将质粒线型化，然,后通过其长度来鉴定其是否
9、为重组子,S,S,B,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分重组子与非重组子,如果外源DNA片段插pUC18的SphI位点处，原则上也可用SphI酶解鉴定，但这样做很不经济，因为SphI非常昂贵（每100单位50美元）。用HindIII和EcoRI联合酶解同样可以达到目的，但这两种酶的价格只及SphI的1 / 50,B,B,E,P,4.0 kb,1.0 kb,0.8 kb,区分目的重组子与非目的重组子,用EcoRI酶切转化子质粒DNA,目的重组子： 3.0 kb + 3.7 kb,或者： 1.0 kb + 5.7 kb,用PstI酶切转化子质粒DNA,目的重组子： 3.2 kb +
10、 3.5 kb,或者： 0.8 kb + 5.9 kb,B,B,E,4.0 kb,2.0 kb,2.0 kb,区分目的重组子与非目的重组子,对图示的克隆片段，转化子质粒DNA用EcoRI酶切开后，只出现2.0 kb和2.7 kb两条带子，实际上2.0 kb的条带中含有两种不同的分子,2.7 kb,2.0 kb,E,部分酶解图谱法,该重组质粒经酶解后，分别得到下列几组数据：,BamHI全酶解：0.6 0.8 1.8 3.4 kb,BamHI+EcoRI全酶解：0.6 0.8 1.8 1.2 2.2 kb,其中，1.2 kb片段的存在表明该片段位于一端,BamHI部分酶解：1.4 2.6 4.0
11、kb,其中，1.4 kb的片段必为0.6 kb和0.8 kb两片段，表,明两者是连在一起的；同理，2.6 kb的片段必为0.8,kb和1.8 kb两片段，表明两者是连在一起的；最后，,4.0 kb的片段必为0.6 kb和3.4 kb两片段，表明两者,是连在一起的,DNA序列测定法,DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定。DNA序列其关键技术有：,DNA链聚合反应时的定点随机中断（ddNTP）,聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率（600 bp / 601 bp）,电脑自
12、动检测、记录、编辑程序,用于DNA测序的专一性试剂盒（Kit）,双脱氧末端终止测序法的基本操作：,DNA聚合反应,聚丙烯酰胺凝胶电泳,双脱氧末端终止测序法的基本反应：,Klenow,OH 3,5 P,T,dNTP + ddATP,T,T,T,T,T,OH 3,5 P,A,G,T,C,GGCATTGCGTTACTAGTCCAGTACA,基于外源基因表达产物的筛选与鉴定,蛋白质生物功能检测法,放射免疫原位检测法,蛋白凝胶电泳检测法,蛋白质生物功能检测法,某些外源基因编码具有特殊生物功能的酶类或活性蛋白（如-淀粉酶、葡聚糖内切酶、-葡萄糖苷酶、蛋白酶、抗生素抗性蛋白等），设计简单灵敏的平板模型，可以
13、迅速筛选出克隆了上述蛋白编码基因的期望重组子。,重组子,利用淀粉酶基因表达产物检测重组子,放射免疫原位检测法,基本原理及操作程序与菌落原位杂交法非常相似，只不过后者是用核酸探针通过碱基互补的形式特异性杂交目的DNA序列，而前者利用抗体通过特异性免疫反应搜寻目标蛋白质。因此使用放射免疫原位检测法筛选鉴定期望重组子的前提条件是外源基因在受体细胞中必须表达出具有正确空间构象的蛋白产物，同时具备与之对应的特异性抗体。,蛋白凝胶电泳检测法,对于那些生物功能难以检测的外源基因编码产物，手头又没有现成的抗体做蛋白免疫原位分析实验，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对重组克隆进行筛选鉴定。,表达产物,非重组子 重组子,
