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1、蛋白质的重要性质,蛋白质的重要性质,（一）胶体性质分子量大，在水中不能成真溶液，成胶体溶液透析：蛋白质溶液放入半透膜内放入水中让其中杂质扩散入水内,（二）两性解离,末端自由-COOH和自由-NH2链中可解离的侧链基团（-NH2，-COOH，胍基，咪唑基等）,等电点（pI）,蛋白质自身净电荷为零时溶液的pH值并不是蛋白质自身电荷数最小时必须在一定离子强度的缓冲液中测定，等电点与缓冲液的种类、缓冲液的离子强度有关。 蛋白质在不含任何其它溶质的纯水中的等电点称等离子点蛋白质的等电点一般偏酸等电点时，蛋白质的溶解度、导电性、粘度、渗透压最小,电泳现象,带电荷的蛋白质离子在电场中向带相反电荷的电极移动,
2、（三）变性和凝固,变性作用 天然蛋白质受物理或化学因素的影响，分子内部原有的高度规则性的空间排列发生变化，致使原有性质和功能发生部分或全部丧失，称变性作用。变性的蛋白质分子相互凝集为固体的现象称凝固,变性的可逆性,变性因素及其作用机制,热变性 破坏氢键酸碱 破坏盐键有机溶剂 降低介电常数；破坏疏水键尿素、胍 破坏氢键及疏水键三氯乙酸 与蛋白质形成溶解度很小的盐振荡 表面作用,变性蛋白质的特征,结晶和生物活性消失溶解度显著减小粘度、旋光性增加，pI提高反应基团数目增加易被酶消化,变性的理论,中国科学家 吴宪 1931年 变性蛋白质其肽链由原来的紧密有序的构象变成松散无序的构象,别构作用(变构作用
3、),概念 含亚基的蛋白质由于一个亚基构象的改变而引起其余亚基和整个分子构象、性质、功能发生改变的作用称别构作用血红蛋白的别构作用,沉淀作用,加酸盐析有机溶剂加重金属盐生物碱试剂抗原抗体反应加热,沉降作用,高速离心时，蛋白质分子趋于下沉沉降速率沉降常数(s)每单位引力场沉降分子下沉的速度1 Svedberg单位110-13 sec,六 蛋白质的结构与功能,(一) 蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构,牛胰RNase变性一复性实验：124个a.a残基 4个链内二硫键。分子量：12600 (8M尿素+硫基乙醇)变性、失活透析后构象恢复，活性恢复95%以上，而二硫键正确复性的概率是1/105。,(二)
4、蛋白质一级结构与生物功能的关系,细胞色素C的种属差异与生物进化镰状细胞贫血病的血红蛋白HBS 链的第6个氨基酸GluVal酶原和激素原的激活,同源蛋白质一级结构的种属差异与生物进化同源蛋白质：在不同的生物体内行使相同或相似功能的蛋白质。如：血红蛋白在不同的脊椎动物中都具有输送氧气的功能，细胞色素在所有的生物中都是电子传递链的组分。,同源蛋白质的特点：同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性（序列同源性）有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称不变残基，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称可变残基，可变残基中，个别氨基酸的变化不影响蛋白质的功
5、能。多肽链长度相同或相近,通过比较同源蛋白质的氨基酸序列的差异可以研究不同物种间的亲源关系和进化。亲源关系越远，同源蛋白的氨基酸顺序差异就越大。,1、 细胞色素C 分子量：12500左右氨基酸残基：100个左右，单链。25种生物中，细胞色素C的不变残基35个。60种生物中，细胞色素C的不变残基27个。亲源关系越近的，其细胞色素C的差异越小。亲源关系越远的，其细胞色素C的差异越大。人与黑猩猩 0人与猴 1人与狗 10人与酵母 44,2、胰岛素有24个氨基酸残基位置始终不变：AB链上6个Cys 不变，其余18个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。其它可变氨基酸对稳定蛋白质的空
6、间结构作用不大，但对免疫反应起作用。猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。,蛋白质一级结构的突变分子病分子病：基因突变引起的某个功能蛋白的某一个或几个氨基酸残基发生了遗传性替代从而导致整个分子的三维结构发生改变，功能部分或全部丧失。镰刀形红细胞贫血现是由于血红蛋白发生了遗传突变引起的链第6位的aa线基由正常的Glu变成了疏水性的Val正常人血红蛋白，.N.Glu 6镰刀型贫血 .N.Val 6生理条件下电荷： Glu- Va10 亲水 疏水,一级结构的部分切除与蛋白质的激活1、 血液凝固的机理 凝血因子（凝血酶原致活因子）凝血酶原 凝血酶 纤维蛋白原A 纤维蛋白B 凝胶
7、,（1）、 凝血酶原,在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274Thr275、Arg323Ile324断裂，释放出48个a.a，产生活性凝血酶。 A链49 a.a B链259 a.a,（2）、 纤维蛋白原,22r2从二条链和二条链的N端各断裂一个特定的肽键-ArgGly-，释放出二个纤维肽A（19个氨基酸）和二个纤维肽B（21个氨基酸），它们含有较多的酸性氨基酸残基。,A、B肽切除后，减少了蛋白质分子的负电荷，促进分子间聚集，形成网状结构。在凝血因子XIIIa（纤维蛋白稳定因子）催化下，纤维蛋白质单体间形成共价健（Gln-Lys结合），生成交联的纤维蛋白。,2、 胰岛素原的激活前胰
8、岛素原，含信号肽。胰岛素原，内质网腔，信号肽被信号肽酶切除。活性胰岛素，高尔基体，切除C肽。,七 蛋白质的修饰,指天然的或人工的对组成蛋白质的氨基酸残基或基团作某些改变从而改变蛋白质的有关性质与功能羟基氨基酸(Ser,Thr,Tyr)的磷酸化与去磷酸化,八 糖蛋白与脂蛋白,糖蛋白短链糖同蛋白质以共价键连接而成的结合蛋白质糖与蛋白质的连接键O-糖苷键 糖的半缩醛羟基与Thr,Ser,Hypro,Hylys的羟基N-糖苷键 糖的半缩醛羟基与Asn的氨基,脂蛋白,脂质同蛋白质以次级键结合 脱辅基蛋白(载脂蛋白 apo ) 脂质细胞脂蛋白血浆脂蛋白乳糜微粒极低密度脂蛋白(VLDL)低密度脂蛋白(LDL
9、)高密度脂蛋白(HDL),低密度脂蛋白(LDL),九 免疫球蛋白,抗体(Ig)， -球蛋白分5类，IgA, IgD, IgE, IgG, IgML 轻链H 重链V VariableC Constant,木瓜蛋白酶切割位点,抗原与抗体抗原是指进入异体机体后，能致敏淋巴细胞产生特异抗体，并能与抗体发生特异结合的物质（主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物）。抗原性包括免疫原性和抗原特异性。免疫原性是指诱导特异免疫反应的能力。抗原特异性是指与抗体特异结合的能力。抗原决定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化学基团决定（一级结构或空间结构），这种决定或控制抗原性的化学基团称抗原决定簇。,抗原决定簇的作用：被免
10、疫活性细胞识别，从而激活免疫活性细胞产生抗体。与相应抗体的Fab结合。抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白，它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白，称免疫球蛋白。抗体具有两个特点：高度特异性多样性几乎所有的外源蛋白都能诱导相应的特异性抗体，人体内任一时刻约有10000种抗体存在。,抗原抗体反应抗体是2价的，抗原是多价的。抗体极度过剩，抗原分子所有价被抗体的饱和，可溶。 抗原一抗体比例适中，形成网状的抗原抗体复合物，不可溶。 抗原极度过剩，抗体被饱和，可溶。 图抗原抗体反应的条件：抗原决定簇与抗体结合部位构象互补。二者各有对应的化学基团，通过作用力使二者结合（离子
11、键、氢键 等）,Key and lock,Interaction between antigen and antibody,Antibody,Antigen,Antigen,Labeled antigen,The first major milestone in antibody-based immunoassays- the development of the competitive binding assay, using radioisotope and later enzyme-labeled immunoassays,基于抗体-抗原相互作用的生化分析方法：酶联免疫吸附测定（ELIS
12、A）Western印迹(Western blot),十 蛋白质的抽提、分离、纯化和鉴定,蛋白质的分离纯化是最艰巨的任务目的 提高蛋白质的比活性原理 分子量； 溶解度； 电荷； 吸附性质； 对其它分子的生物亲和力,1 抽提,破细胞动物组织 匀浆；反复冻融植物 研磨细菌 超声波振荡；研磨；溶菌酶,提取pH：选择合适pH的缓冲液，如Tris，磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待分离蛋白在此pH条件下稳定。温度：低温如4-10，蛋白酶活性较低。离子强度：如0.1-0.2 M NaCl或KCl.其他成分：还原剂 NaHSO4，维生素C巯基保护剂 DTT，巯基乙醇金属螯合剂 EDTA，EGTA蛋白酶抑
13、制剂 PMSF,分离细胞器如目的蛋白在某一细胞组分内(细胞核、染色体、核糖体等)除核酸酶法DNase,Rnase超声除脂肪丙酮脂肪酶除盐超滤凝胶过滤冻干,2 分离,粗分级 简便，处理量大，浓缩蛋白质溶液等电点沉淀盐析 (NH4)2SO4沉淀稀释沉淀有机溶剂沉淀吸附超滤,等电点沉淀盐析与盐溶,3 纯化,规模小，分辨率高凝胶过滤(分子筛层析、分子排阻层析) 利用蛋白质分子量的不同 Sephadex Bio-Gel Sepharose,凝胶过滤,大分子量的先出来小分子量的后出来, 纤维素离子交换层析,利用蛋白质电荷的性质阳离子: 羧甲基纤维素 (CM-) -O-CH2-COO阴离子: 二乙基氨基乙基
14、纤维素 (DEAE-) -O-CH2-CH2-NH(C2H5)2,-,+,纤维素离子交换层析, 亲和层析,蛋白质能与特异的配体结合(专一、非共价、可逆)配体常连接在琼脂糖凝胶(Sepharose)上配体选择：抗原抗体酶抑制剂酶底物激素受体金属结合蛋白螯和剂糖蛋白凝集素,亲和层析是最好的纯化方法之一, 电泳法,电泳是指带电粒子在直流电场中移动的现象。最常用：聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种利用人工合成的凝胶作为支持介质的区带电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺经过聚合交联从而形成的三维空间凝胶网络。蛋白质电泳迁移率取决于蛋白质的电荷、分子量和形状
15、,超离心法结晶法HPLC(高压液相色谱),4 鉴定,纯度鉴定PAGEHPLC结晶超离心N-端测定,分子量测定凝胶过滤 LgM洗出液体积 作图SDS-PAGE LgM相对电泳迁移率 作图,SDS-PAGE,如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小，当蛋白质的分子量在15，000200，000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系，符合如下方程式： lg MW = b m R + K 其中，MW 为蛋白质的分子量，m R 为相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数。因此通过已知分子量的蛋白与
16、未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量。,970006600043000310002010014400,等电点的测定凝胶等电聚焦,等电聚焦是在凝胶中加入两性电解质(ampholine)从而构成从正极到负极pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等电点。,浓度鉴定,紫外法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸收。Folin-酚法(Lowry法)：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。Bradford法：蛋白质与考马斯亮蓝染料(G-250) 结合。克氏定氮法双缩脲法,生物活性测定最终目的比活性提高 (活性/mg蛋白质),
