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1、电泳技术介绍,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE),基本原理,1.SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。2.蛋白质样品在100用SDS和还原剂处理，可解聚成亚基,加入SDS，改变了蛋白质的构象。3.各种SDS-蛋白质复合物均带相同密度的负电荷，其荷电超过了原蛋白质，消除了不同蛋白质的荷电差异。,图解,多孔凝胶,混合大分子,电泳,操作流程,制胶,上样,电泳,染色,脱色,制胶1将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好2 按照配方制备分离胶，
2、TEMED在灌胶前加入混匀，迅速灌胶3 在分离胶上迅速并轻柔的加上水或无水乙醇进行水封（凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面）4 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟,具体步骤,上样按一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGE电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量。电泳打开电源将电压调到80v（一般15min左右），待样品跑过压缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止。,染色将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液（考马斯亮蓝），用摇床摇23h脱色待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。将脱色液倒掉，可
3、以用Quality One，或者相应的成像系统拍照、分析、估算蛋白浓度。,等电聚焦电泳 (Isoelectro focusing IEF or EF),等电聚焦电泳 ，是利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可到达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。适用: 1.研究蛋白质微观不均一性 2.测定蛋白质等电点,基本原理,Company Logo,用电流在凝胶溶液中建立一个稳定的PH梯度,蛋白质移动到它们各自的等电点，不同等电点的蛋白质被分开,Company Logo,H梯度构建,载体两性电解质pH梯度(Carrier ampholyt
4、es pH gradients，CA):在电场中通过两性缓冲离子建立的pH梯度。 固相pH梯度（immobilized pH gradients，IPG） 将缓冲基团共价键合在介质上成为凝胶介质的一部分而建立pH梯度（线性和非线性），分辨率比前者高一个数量级。,载体两性电解质（CA）应具备的条件,(1)在等电点处必需有足够的缓冲能力 (2)在等电点必需有足够高的电导 (3)分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。(4)化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。(5)应不与分离物质反应或使之变性。,操作流程,1,2,3,4,制胶,装管,装槽，电泳,剥胶,5,固定,测定pH梯度,
5、具体步骤,1. 配胶2. 装管 每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管的容量约为1.5-1.8ml）,液面加至距管口1mm处，用注射器轻轻加入少许H2O，进行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约30分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。,3. 装槽和电泳 用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500ml 0.1M H3PO4，下槽加入500m
6、l 0.1M NaOH，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V，聚焦2至3小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。,4. 剥胶 取下胶管，用H2O 将胶管和两端洗2次，用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端注入H2O少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极端为“尾”，若分不清时，可用pH试纸鉴定，酸性端为正，碱性端为负。,5. 固定 取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固
7、定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“L”。 固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm或238nm波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。,6. 测定pH梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH胶条的长度“L1”。按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成10mm长的小段，分别置于小试管中，加入1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长pH复合电极的pH计测出每管浸出液的pH值。,优缺点,优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，不仅可测定蛋白或多肽的等
8、电点而且能将不同等电点的混合生物大分子进行分离和鉴定 。缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性的蛋白。,双向电泳（2-D electrophoresis）,Company Logo,基本原理,第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离（将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度），至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。,第一向：等电聚焦电泳,第二向：SDS-PAGE,水平方向：反映出蛋白在pI上的差异垂直方向：反映出它们在分子量上的差别,图解,2D电泳操作流程,挖点酶解点靶,蛋白鉴定,分离,双向电泳
9、第一向第二向,图谱分析,图像获取图谱分析,1.样品制备2.固相预制胶条的水化3.第一向等电聚焦3.1. 取出IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温平衡。3.2. 在聚焦盘或水化盘中加入样品。3.3. 去除预制IPG胶条上的保护层 。,具体步骤,3.4. 将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中 。3.5. 在每根胶条上覆盖1ml矿物油。3.6. 对好正、负极，盖上盖子。3.7. 设置等电聚焦程序。4.胶条的平衡4.1冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。,4.2配制胶条平衡缓冲液 I 。4.3吸去胶条上的矿物油及多余的样品。4.4第一次平衡。振荡15分钟。4.5配制胶条平衡缓冲液 II 。4.6第二次平衡 ，振荡15分钟。4.7吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。,4.8琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1电泳缓冲液。5.第二向SDS-PAGE电泳6.凝胶的染色及检测7.PDQuest软件分析8.质谱鉴定,Thank You !,
